以hT ERT为靶点设计合成的新型二氢吡唑类化合物抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的作用机制研究

发布时间：2017-05-23 23:00

  本文关键词：以hT ERT为靶点设计合成的新型二氢吡唑类化合物抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人端粒酶是由人端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)、人端粒酶RNA(hTR)以及人端粒酶相关蛋白(hTP1)等部分组成。端粒酶自1994年被发现以来,由于其在负责维持染色体完整性、细胞永生化以及肿瘤发生发展方面的关键作用而被广泛研究。因此,以端粒酶作为抗肿瘤药物筛选的新靶点成为了当下研究的热点,人们虽已发现或者设计合成了具备一定作用的抑制剂,但由于直到2008年端粒酶的晶体结构才被确认,以hTERT为作用靶点的高选择性和高效的先导结构及其药理学作用机制研究至今仍然很少有报道。因此,本课题组基于端粒酶hTERT蛋白的晶体结构和潜在活性中心,初步建立了分子对接模型,虚拟筛选出了一些高活性的骨架结构,并以此为骨架基础设计合成了一系列小分子化合物。同时对这一系列合成的小分子化合物进行抗癌活性筛选和药理学机制研究。本课题的主要研究内容如下:1.目标化合物设计与合成基于端粒酶hTERT蛋白的晶体结构和潜在活性中心,初步建立了该抑制剂的分子对接模型,虚拟筛选出了一些高活性的骨架结构的化合物,并通过药物化学的方法合成出这一系列化合物。2.检测小分子化合物对肿瘤细胞株增殖的影响对设计合成的小分子化合物进行抗癌活性筛选:在人肝癌细胞株smmc-7721、人肝癌细胞株hepg2、人胃癌细胞株mgc-803以及人乳腺癌细胞株mcf-7上进行mtt实验,结果发现这一系列化合物中化合物4a对smmc-7721肿瘤细胞的增殖作用抑制效果最明显。同时,通过流式细胞术观察化合物4a对smmc-7721肿瘤细胞周期的影响,实验发现smmc-7721细胞经化合物4a处理48h后s期细胞数显著增多,而在g0/g1期细胞显著减少,这提示化合物4a是通过阻滞细胞于s期实现抑制细胞增殖作用的。3.检测化合物4a对端粒酶活性以及htert的作用通过改良的trap实验法检测肿瘤细胞中端粒酶活性:实验结果显示,化合物4a对端粒酶活性亦表现出较强的抑制作用,ic50值为7.81±1.32μm。同时通过westernblot实验检测htert蛋白表达变化,结果显示用化合物4a处理细胞48h后htert蛋白的表达量下降。提示化合物4a对htert蛋白以及端粒酶活性具有较强的抑制作用。4.检测化合物4a对nf-κb/p65信号通路的影响,检测p65、il-6以及tnf-α表达的变化通过q-pcr及westernblot实验,发现化合物4a对smmc-7721肝癌细胞中nf-κb信号通路中关键分子p65的蛋白表达及其下游的信号分子如il-6和tnf-αmrna和蛋白的表达具有下调作用,这提示化合物4a抑制smmc-7721细胞增殖作用可能与nf-κb/p65信号通路有关。5.过表达htert,检测化合物4a对nf-κb/p65信号通路中p65、il-6、tnf-α的影响。wersternblot以及q-pcr实验结果发现,过表达组p65蛋白表达以及il-6和tnf-αmrna和蛋白的表达量明显增多,用化合物4a处理48h后表达量明显下降,这提示人肝癌细胞株smmc-7721中随着htert表达量的升高,p65蛋白表达以及il-6和tnf-αmrna和蛋白的表达水平明显上调,同时化合物4a对p65蛋白表达以及il-6和tnf-αmrna和蛋白的表达水平具有明显下调的作用。该结果进一步提示通过作用于htert,化合物4a对下游nf-κb/p65信号通路产生作用从而抑制smmc-7721肝癌细胞增殖。综上所述,本课题组以分子对接模型筛选出的靶向hTERT的高活性骨架结构——N-砜基-芳基二氢吡唑为基础,设计、合成了一系列新型二氢吡唑类化合物,同时通过药理学实验方法筛选出了一个潜在的小分子抑制剂——化合物4a,并对其可能的药理学作用机制进一步研究探讨。一系列实验结果发现通过靶向hTERT抑制端粒酶活性,化合物4a将SMMC-7721肝癌细胞阻滞于S期,实现抑制细胞增殖的目的。同时发现这种作用的实现可能和细胞增殖活化相关的NF-κb/P65经典信号通路的下调密切相关。
【关键词】：人端粒酶逆转录酶hTERT SMMC-7721细胞 二氢吡唑类 抑制增殖 NF-κb P65信号通路
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5;R91
【目录】：

• 中英文缩略词对照6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 1.前言13-15
• 2.实验材料15-18
• 2.1 肿瘤细胞株15
• 2.2 药物与试剂15-16
• 2.3 主要溶液配制16-18
• 2.4 仪器与设备18
• 2.5 图像软件分析18
• 3.实验方法18-28
• 3.1 细胞培养18-19
• 3.2 MTT实验检测细胞的增殖19-20
• 3.3 改良的TRAP法检测端粒酶活性20-21
• 3.4 流式细胞术检测细胞周期21
• 3.5 Q-PCR方法检测肿瘤细胞中mRNA的表达水平21-24
• 3.5.1 细胞总RNA提取22
• 3.5.2 RNA的定量22
• 3.5.3 逆转录过程22-23
• 3.5.4 Q-PCR反应23-24
• 3.6 Western-blot方法检测肿瘤细胞中蛋白的表达24-26
• 3.6.1 细胞蛋白的提取24
• 3.6.2 BCA法蛋白定量24-25
• 3.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳法25
• 3.6.4 电转移25-26
• 3.6.5 免疫印迹26
• 3.6.6 凝胶图象分析26
• 3.7 pCI-neo-hTERT质粒瞬时转染进入SMMC-7721肝癌细胞26-28
• 3.7.1 抽提质粒26-27
• 3.7.2 pCI-neo-hTERT质粒转染27-28
• 4.数据处理28
• 5.实验结果28-42
• 5.1 小分子化合物的设计思路和合成28-34
• 5.1.1 小分子化合物的设计思路28-29
• 5.1.2 小分子化合物的合成29-30
• 5.1.3 目标化合物的结构表征及原始图谱30-34
• 5.2 抗癌活性的筛选34-35
• 5.3 化合物 4a对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期的影响35-37
• 5.4 化合物 4a对hTERT的作用研究37-39
• 5.4.1 计算机辅助药物分子模型设计37
• 5.4.2 化合物 4a对端粒酶活性的影响37-38
• 5.4.3 化合物 4a对hTERT的蛋白水平的影响38-39
• 5.5 化合物 4a抑制人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中P65、IL-6 以及TNF-a的表达39-40
• 5.6 化合物 4a调控hTERT对人肝癌细胞株SMMC-7721中NF-κb/P65信号通路的影响40-42
• 6.讨论42-45
• 7.小结45-46
• 8 参考文献46-49
• 个人简历49-52
• 致谢52-54
• 综述54-67
• 参考文献63-67

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