匹诺塞林生物合成相关基因的克

发布时间：2017-05-25 12:26

  本文关键词：匹诺塞林生物合成相关基因的克隆、功能鉴定及工程菌的构建，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：黄酮类化合物是植物中种类最多、分布最广的次级代谢产物家族,目前有超过9000种黄酮类化合物被发现。其具有较多药理活性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、神经保护等,此外,黄酮类化合物在化妆品、工业原料等方面也有重要的应用价值,使得黄酮类化合物一直是研究热点。根据结构骨架,可以分为黄酮醇、黄酮类、黄烷酮类、异黄酮类、儿茶素类和花色苷类。匹诺塞林是一种广泛存在于植物中的二氢黄酮类化合物,具有很好的生物活性,如神经保护、抗菌、抗氧化等。在2009年,匹诺塞林被CFDA批准为Ⅰ类注射新药,主要用于治疗急性脑卒中,现已经进入Ⅱ期临床试验阶段。匹诺塞林的良好成药性使其合成方法备受关注。匹诺塞林可以通过化学合成、植物提取和合成生物学技术进行制备。合成生物学技术是一种环境友好的工程化生物技术,代表未来匹诺塞林的合成发展方向。匹诺塞林的生物合成途径中有三个关键酶：对香豆酸辅酶A连接酶、查尔酮合酶、查尔酮异构酶。由于查尔酮异构酶具有空间选择性,利用合成生物学技术制备的匹诺塞林为2S构型,单立体异构体对药物的申报上市具有很重要意义。本论文还进行了法呢基焦磷酸合酶的研究。其作为一种异戊烯基转移酶,可以催化IPP和DMAPP生成法呢烯焦磷酸(FPP),而FPP既参与合成倍半萜类化合物,也参与合成三萜皂苷和甾体皂苷等化合物,即FPPS处于单萜和倍半萜生物合成途径分支处,是异戊二烯生物合成途径中的关键酶。对法呢基焦磷酸合成酶的研究为虎眼万年青(Ornithogalum caudatum)中萜类天然药物生物合成途径的重构提供了必要的基因元件,为推动萜类天然药物合成生物学的研究奠定基础。本研究围绕(2S)-匹诺塞林的合成生物学制备,从虎眼万年青中克隆得到了匹诺塞林生物合成途径中的三个关键酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI,进行了功能鉴定,在此基础上构建工程菌,获得了具有立体异构体的(2S)-匹诺塞林,并研究了其药理活性。主要取得如下结果：1.关键酶基因家族的克隆与表达通过对虎眼万年青转录组测序、数据分析,通过提取总mRNA,逆转录得cDNA,设计引物克隆得到匹诺塞林生物合成途径中三个关键酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI的unigene,其中Osa4CL家族含有7条unigene、OsaCHS家族含有3条unigene条和OsaCHI家族含有1条unigene,利用In-Fusion原理构建了原核表达载体,并进行诱导,实现了Osa4CL1、Osa4CL2、Osa4CL3、Osa4CL4、Osa4CL5、Osa4CL6、Osa4CL7、 OsaCHS1、OsaCHS2、OsaCHS3和OsaCHI表达。2.关键酶的功能鉴定在一条代谢通路通中,只有一个未知功能酶,若验证该途径是通畅的,则可以说明该关键酶具有活性。本文通过构建工程菌的方法对已经实现表达的关键酶进行功能鉴定,发现Osa4CL1、OsaCHS2和OssaCHI具有功能。工程菌发酵产物经波谱解析鉴定了结构,特别是进行了圆二色谱的检测,产物为匹诺塞林,且为单立体异构体,是2S构型。首次对微生物来源的(2S)-匹诺塞林进行了药理学活性检测,实验目前正在进行中。3.工程菌的构建及优化围绕已构建工程菌产量问题,本文从以下几点对工程菌进行优化：选取高活性关键酶、模块化组装和对关键酶基因进行密码子优化,即选择紫花苜蓿来源的MsCHI,设计了三种模块化组装模式和对Osa4CL、OsaCHS和MsCHI进行了密码子优化。三种模块化组装模式中只有第一种具有催化活性,在对密码子进行优化后,产量提高了1.66倍。4.法呢基焦磷酸合酶的研究通过对虎眼万年青转录组测序、数据分析,得到了1327 bp的法呢基焦磷酸合酶基因unigene,通过ORF分析发现有1044 bp开放阅读框,命名为OsaFPPS,通过生物信息学分析发现其等电点是5.01,进化树分析发现其属于植物类FPPS家族。通过构建表达载体进行表达后经SDS-PAGE电泳及western-blot检测,在体外酶促反应后由GC-MS法检测,发现其可以催化IPP和DMPP。
【关键词】：虎眼万年青 (2S)-匹诺塞林 合成生物学 对香豆酸辅酶A连接酶 查尔酮合酶 查尔酮异构酶 法呢基焦磷酸合酶
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5
【目录】：

• 英文缩略词表7-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一部分 匹诺塞林生物合成相关基因的克隆功能鉴定及工程菌的构建14-95
• 第一章 前言14-23
• 1.1 匹诺塞林生物合成途径14-16
• 1.2 匹诺塞林生物生物活性16-18
• 1.3 匹诺塞林的制备方法18-19
• 1.3.1 匹诺塞林的化学合成18
• 1.3.2 匹诺塞林的植物提取18-19
• 1.3.3 匹诺塞林的生物合成19
• 1.4 提高合成生物学法合成匹诺塞林的策略19-21
• 1.5 匹诺塞林生物合成的意义21-22
• 1.6 虎眼万年青中匹诺塞林相关基因克隆鉴定意义22-23
• 第二章 材料与方法23-33
• 2.1 主要仪器设备及生产厂家23-24
• 2.2 实验材料24-27
• 2.2.1 标准品及常用试剂24-25
• 2.2.2 常见溶液配方25-27
• 2.3 植物材料27
• 2.4 抗生素的配制27
• 2.5 试剂盒及酶等生化试剂27-28
• 2.6 菌株及质粒28
• 2.7 常用实验方法28-33
• 2.7.1 感受态制备方法(CaCl_2法)28
• 2.7.2 克隆载体连接28
• 2.7.3 大肠杆菌的转化28-29
• 2.7.4 重组子的筛选29
• 2.7.5 重组蛋白的诱导29-30
• 2.7.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)30
• 2.7.7 蛋白染色30
• 2.7.8 蛋白纯化、透析及冷干30-31
• 2.7.9 Western-Blot方法31-32
• 2.7.10 密码子优化32
• 2.7.11 匹诺塞林工程菌的构建及发酵32-33
• 第三章 对香豆酸辅酶A连接酶功能鉴定33-43
• 引言33
• 3.1 实验方法33-35
• 3.1.1 虎眼万年青转录组测序及序列分析33
• 3.1.2 虎眼万年青全cDNA合成及Osa4CL的克隆33-34
• 3.1.3 表达载体构建34
• 3.1.4 重组Osa4CL蛋白表达和检测34
• 3.1.5 Osa4CL蛋白酶功能鉴定34-35
• 3.2 实验结果35-42
• 3.2.1 生物信息学分析35-39
• 3.2.2 重组蛋白的诱导表达检测39-40
• 3.2.3 Osa4CL家族的功能鉴定40-42
• 3.3 本章小结42-43
• 第四章 查尔酮合酶和查尔酮异构酶的克隆、功能鉴定43-68
• 引言43-44
• 4.1 实验方法44-50
• 4.1.1 OsaCHS和OsaCHI克隆及表达载体的构建44-45
• 4.1.2 重组蛋白的诱导表达、纯化及Western-Blot检测45
• 4.1.3 OsaCHS蛋白家族酶功能鉴定45-49
• 4.1.3.1 酶促反应法45-46
• 4.1.3.2 构建匹诺塞林工程菌法46-49
• 4.1.4 OsaCHI蛋白酶功能鉴定49-50
• 4.2 实验结果50-66
• 4.2.1 OsaCHS和OsaCHI生物信息学分析50-54
• 4.2.2 OsaCHS和OsaCHI诱导表达和Western-Blot检测54-55
• 4.2.3 OsaCHS功能鉴定55-65
• 4.2.3.1 体外酶促反应鉴定法55-57
• 4.2.3.2 构建工程菌法57-65
• 4.2.4 OsaCHI功能鉴定65-66
• 4.3 本章小结66-68
• 第五章 匹诺塞林工程菌的构建及优化68-79
• 引言68-69
• 5.1 实验方法69-74
• 5.1.1 发酵产物定量69
• 5.1.2 关键酶物种选择和模块化组装69-72
• 5.1.2.1 关键酶物种选择69
• 5.1.2.2 模块化组装69-72
• 5.1.3 密码子优化72-74
• 5.2 实验结果74-77
• 5.2.1 匹诺塞林标准曲线绘制74-75
• 5.2.2 关键酶模块化组装75-76
• 5.2.3 密码子优化76-77
• 5.3 本章小结77-79
• 第六章 全文总结79-82
• 6.1 主要内容和意义79-81
• 6.1.1 关键酶Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI基因家族的克隆与表达79
• 6.1.2 关键酶Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI蛋白家族的功能鉴定79-80
• 6.1.3 (2S)-匹诺塞林工程菌优化80-81
• 6.2 本论文创新点81
• 6.3 工作展望81-82
• 参考文献82-88
• 附录88-95
• 附图88-94
• 附表94-95
• 第二部分 来源于虎眼万年青的法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、表达及功能鉴定95-111
• 第一章 前言95-96
• 第二章 实验材料和方法96-97
• 2.1 实验材料96
• 2.1.1 标准品及底物96
• 2.1.2 生化试剂和酶96
• 2.1.3 植物材料96
• 2.2 本实验涉及溶液配方和操作96-97
• 第三章 实验方法97-100
• 3.1 虎眼万年青转录组测序、序列分析及生物信息学分析97
• 3.2 OsaFPPS的基因克隆97-98
• 3.3 OsaFPPS的大肠杆菌表达载体构建98-99
• 3.4 OsaFPPS的表达、Western-Blot法验证及纯化99
• 3.5 OsaFPPS功能的鉴定99-100
• 第四章 实验结果100-107
• 4.1 OsaFPPS基因的生物信息学分析及克隆100-103
• 4.1.1 生物信息学分析100-102
• 4.1.2 OsaFPPS的克隆102-103
• 4.2 OsaFPPS表达载体构建、表达、Western-Blot法验证及纯化103-104
• 4.2.1 OsaFPPS表达载体构建、表达及验证103
• 4.2.2 OsaFPPS纯化103-104
• 4.3 OsaFPPS功能鉴定104-107
• 第五章 实验讨论107-108
• 第六章 全文总结108-109
• 参考文献109-111
• 致谢111-113
• 个人简介113-114

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 张必弦;朱延明;来永才;胡小梅;李炜;李琬;毕影东;肖佳雷;张俐俐;;植物查尔酮合酶(CHS)及其基因的研究进展[J];安徽农业科学;2012年20期

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  本文关键词：匹诺塞林生物合成相关基因的克隆、功能鉴定及工程菌的构建，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：393749