IFITM5基因c.-14C＞T定点突变对Saos-2细胞生物学功能的影响

发布时间：2017-05-25 06:13

  本文关键词：IFITM5基因c.-14C＞T定点突变对Saos-2细胞生物学功能的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:干扰素诱导跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein 5,IFITM5)是干扰素诱导跨膜蛋白家族成员之一,是一种成骨细胞特异性膜蛋白,在成骨细胞分化阶段表达量增加,尤其是骨基质形成期和矿化阶段达到峰值,具有促进成骨细胞矿化的作用。Ⅴ型成骨不全患者中均发现存在IFITM5基因的5'UTR的c.-14CT突变,该类患者临床特征主要是前臂骨间膜钙化和增生性骨痂形成。此外,IFITM5还参与了肿瘤抑制通路,对癌细胞具有抗增殖的作用,该蛋白具有肿瘤抑制的性质,可以在肿瘤形成之前起调制作用,推测该基因可能与肿瘤疾病的发生或发展密切相关。目的:本实验旨在探究IFITM5基因c.-14CT定点突变对人骨肉瘤细胞生物学功能的影响。方法:应用Real-time PCR和Western blotting的方法检测癌细胞和转染Saos-2细胞的IFITM5 m RNA和蛋白水平的表达情况。通过将构建好的pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型、pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型质粒转染Saos-2细胞,采用MTT、细胞划痕、细胞凋亡和transwell的方法测定细胞的增殖、迁移、凋亡和侵袭的情况。转染Saos-2细胞诱导矿化后采用茜素红染色法观察矿化结节的形成,并应用实时荧光定量PCR检测分化标志蛋白ALP、OCN、Runx2等基因的表达。结果:IFITM5在癌细胞系中存在并有表达差异,在骨肿瘤以及人卵巢癌细胞系中高表达;在肝癌H7402与横纹肌肉瘤RD等细胞中表达量低(p0.05)。构建好的pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型、pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型质粒瞬时转染Saos-2细胞后采用MTT、细胞划痕、细胞凋亡和transwell的方法测定细胞的增殖、迁移、凋亡和侵袭的变化,结果表明pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型、pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型比空白对照组的细胞增殖能力、迁移速率、凋亡速率、侵袭能力稍有降低,但野生型和突变型实验组无明显差别(p0.05);茜素红染色实验发现,相比于空白对照组,在诱导矿化72h后pc DNA4-IFITM5-E12-W和pc DNA4-IFITM5-E12-MU组均促进矿化结节的形成;实时荧光定量PCR检测矿化标志蛋白ALP、OCN、Runx2,相比于对照组,pc DNA4-IFITM5-E12-W和pc DNA4-IFITM5-E12-MU组ALP、OCN、Runx2的m RNA表达量均上升。pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型IFITM5 m RNA表达水平明显高于pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型(p0.05)。通过Real-time PCR和Western blotting的方法发现pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型、pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型比空白对照组的IFITM5 m RNA和蛋白表达水平均显著上升(p0.05),pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型IFITM5 m RNA和蛋白表达水平明显高于pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型(p0.05)。结论:IFITM5在癌细胞系中存在并有表达差异。pc DNA4-IFITM5-E12-W野生型、pc DNA4-IFITM5-E12-MU突变型质粒能促进IFITM5的表达,但对细胞增殖能力、迁移速率、凋亡速率、侵袭能力等细胞生物学功能无明显影响,验证了IFITM5促进成骨细胞矿化的作用。
【关键词】：IFITM5 成骨细胞 矿化 癌细胞 pc DNA4
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 导师简介5
• 课题组成员5-9
• 摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 主要符号表13-14
• 前言14-20
• 1 IFITM5基因14-16
• 1.1 IFITM5研究背景14
• 1.2 IFITM5功能14-16
• 2 IFITM5与Ⅴ型成骨不全16-17
• 3 肿瘤细胞生物学特性研究方法17-20
• 第一章 IFITM5在不同癌细胞中的差异表达20-33
• 1 材料与方法20-30
• 1.1 材料20-22
• 1.1.1 细胞20
• 1.1.2 试剂20-21
• 1.1.3 仪器21-22
• 1.2 方法22-30
• 1.2.1 细胞培养及传代22
• 1.2.2 RT-QPCR测定转录因子mRNA表达水平22-25
• 1.2.3 Western Blotting检测IFITM5的表达25-29
• 1.2.4 统计学方法29-30
• 2 结果30-31
• 2.1 不同癌细胞系中IFITM5 mRNA表达差异30
• 2.2 不同癌细胞系中IFITM5蛋白表达差异30-31
• 3 讨论31-33
• 第二章 IFITM5基因c.-14C>T定点突变对Saos-2 细胞生物学功能的影响33-47
• 1 材料与方法33-40
• 1.1 材料33-34
• 1.1.1 细胞和质粒33-34
• 1.1.2 试剂34
• 1.1.3 仪器34
• 1.2 方法34-40
• 1.2.1 Saos-2 细胞培养及传代34
• 1.2.2 pc DNA4质粒提取34-36
• 1.2.3 Saos-2 细胞瞬时转染36
• 1.2.3.1 细胞种板36
• 1.2.4 IFITM5基因c.-14C>T定点突变对Saos-2 细胞生物学功能的影响36-40
• 2 结果40-45
• 2.1 pcDNA4质粒转染Saos-2 细胞mRNA水平的表达40-41
• 2.2 pcDNA4质粒转染Saos-2 细胞IFITM5蛋白表达41
• 2.3 pcDNA4质粒转染Saos-2 细胞对细胞增殖的影响41-42
• 2.4 pcDNA4质粒转染Saos-2 细胞对细胞迁移的影响42-43
• 2.5 pcDNA4质粒转染Saos-2 细胞对细胞凋亡的影响43-44
• 2.6 pcDNA4质粒转染Saos-2 细胞对细胞侵袭的影响44-45
• 3 讨论45-47
• 第三章 IFITM5对Saos-2 细胞矿化的功能研究47-55
• 1 材料与方法47-50
• 1.1 材料47-48
• 1.1.1 细胞47
• 1.1.2 试剂47-48
• 1.1.3 仪器48
• 1.2 方法48-50
• 1.2.1 Saos-2 细胞培养与转染48-49
• 1.2.2 IFITM5定量检测49
• 1.2.3 茜素红染色49-50
• 1.2.4 ALP、OCN、Runx2定量检测50
• 2 结果50-53
• 2.1 Saos-2 细胞转染前后IFITM5的表达变化50-51
• 2.2 茜素红染色法检测Saos-2 细胞的矿化程度51-52
• 2.3 Real-time PCR检测各组Runx2、ALP、OCN的mRNA的表达52-53
• 3 讨论53-55
• 参考文献55-60
• 附录60-61
• 综述61-66
• 参考文献64-66
• 在校期间发表论文66-67
• 致谢67

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