免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid在乳腺癌转移模型中的活性评价

发布时间：2017-05-24 20:03

  本文关键词：免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid在乳腺癌转移模型中的活性评价，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:乳腺癌是全世界女性中发病率最高的恶性肿瘤,是癌症死亡的第二大原因[1]。约16%到20%的病患是深度或转移型,50%的早期患者最终也会发展为转移[2]。手术治疗后复发率较高,放化疗由于缺乏特异性对正常组织的毒害大。故本课题研究新一代靶向疗法—免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid在乳腺癌转移模型中的应用,为其成为临床治疗的候选分子提供依据。方法:由第四军医大学生化与分子生物学科室研发的免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid由靶向HER2的抗体e23sFv,转位域TD及人体促凋亡分子t Bid构成。小鼠乳腺癌转移模型在很重要的层面上可以模拟人体乳腺癌的生物学特征,但在建模过程当中具备高浸润性的BALB/c乳腺癌上皮细胞4T1 HER2表达量较低,而且与人肿瘤细胞表面HER2分子存在序列层面的差别,故在评价人源性的目标分子的疗效时需对其进行HER2的人源化改造[4]。近年来,新型活体成像技术在转移灶的检测和肿瘤细胞转移的监测方面发挥着重要作用,其发光原理是荧光素底物与荧光酶结合产生光学信号,故需对4T1进行报告基因Fluc的修饰,使其表达荧光酶[5]。实验通过慢病毒体系对4T1进行修饰得到稳转细胞株Fluc-4T1/HER2,通过荧光酶活性检测实验及体外发光实验确定作为报告基因的荧光素酶的成功表达,经流式细胞检测技术确定表面HER2蛋白的过表达。通过尾静脉、左心室、原位接种方式建立乳腺癌转移模型,对比得出条件稳定、方便可行、适于评价的途径,用于e23sFv-TD-tBid生物活性的评价。功能学实验,体外通过MTT检测e23sFv-TD-tBid对Fluc-4T1/HER2杀伤作用,体内正式构建转移模型,分高中低剂量注入e23sFv-TD-tBid蛋白,分别从转移信号、成瘤结节统计、Tunnel凋亡结果这3个指标得出目标杀伤分子对肿瘤细胞的作用,进而评价其在转移模型中的生物活性。结果:荧光酶活性检测实验,4T1和4T1-FLuc的光学信号有显著性差异;体外发光实验4T1-FLuc的光学信号随细胞浓度呈梯度变化;流式细胞检测技术通过对比感染前后HER2的表达分数说明HER2的阳性表达;三种方法均成功的构建乳腺癌转移模型,区别在于转移时间与转移部位;MTT结果呈现Fluc-4T1/HER2细胞的生存率与给药浓度的负向相关关系;体内实验,转移信号图说明给药组与对照组转移程度有显著性差异,给药浓度越大,转移程度越小;肺结节统计图说明给药组与对照组肺结节数目有统计学差异,给药浓度越大,肺转移结节越少;Tunnel染色结果说明药物浓度愈大,细胞杀伤效应愈强。结论:荧光酶活性检测实验、体外发光实验及流式细胞检测技术说明稳转细胞系Fluc-4T1/HER2的成功建立;对比三种方法,尾静脉注射方式转移部位稳定、发生率高、周期短、易于控制细胞数量,适合研究转移后期的治疗;体内体外实验均证实e23sFv-TD-tBid对Fluc-4T1/HER2具有杀伤作用;可以减小转移程度、延长转移时间、增进肿瘤细胞的凋亡。
【关键词】：表皮生长因子受体 免疫促凋亡分子 基因修饰 转移瘤模型 活体成像
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 BALB/c乳腺癌上皮细胞 4T1的基因修饰14-27
• 1 材料与方法14-21
• 1.1 实验材料14-15
• 1.2 4T1细胞的培养及药杀实验15-17
• 1.3 慢病毒包装17-18
• 1.4 Fluc-4T1/HER2的稳定建系18-21
• 2 结果21-23
• 2.1 4T1细胞药物杀伤预实验结果21
• 2.2 报告基因Fluc的检测结果21-22
• 2.3 HER2基因的检测结果22-23
• 3 讨论23-26
• 3.1 细胞培养技术应注意的问题23
• 3.2 HER2/4T1-Luc稳定建系的意义23-24
• 3.3 细胞药杀预实验的意义24
• 3.4 载体的耐药性24
• 3.5 包装慢病毒应注意的问题24-26
• 4 结论26-27
• 第二部分 乳腺癌转移模型的建立27-38
• 1 材料与方法27-31
• 1.1 实验材料27-28
• 1.2 三种建模途径的对比28-31
• 2 结果31-35
• 2.1 活体成像结果31-33
• 2.2 HE染色结果33-34
• 2.3 转移情况对比结果34-35
• 3 讨论35-37
• 3.1 建模细胞的状态35
• 3.2 乳房垫原位注射建模时应注意的问题35
• 3.3 尾静脉注射建模时应注意的问题35
• 3.4 左心室注射建模时应注意的问题35-37
• 4 结论37-38
• 第三部分 e23sFv-TD-t Bid的功能学实验38-49
• 1 材料与方法38-42
• 1.1 实验材料38-39
• 1.2 目标促凋亡分子e23sFv-TD-tBid对Fluc-4T1/HER2细胞的生长抑制实验39-40
• 1.3 目标促凋亡分子e23sFv-TD-tBid的体内抗乳腺癌转移活性40-42
• 2 结果42-47
• 2.1 e23sFv-TD-tBid对Fluc-4T1/HER2细胞的生长抑制实验结果42-44
• 2.2 免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid的体内抗乳腺癌转移结果44-47
• 3 讨论47-48
• 3.1 体内体外实验结合的意义47
• 3.2 给药剂量的设定47
• 3.3 药物分子竞争结合的饱和性47-48
• 4 结论48-49
• 参考文献49-51
• 综述51-64
• 参考文献60-64
• 致谢64-65
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果65-66
• 个人简历66

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本文编号：391802