PGE2通过EP4-cAMP通路调节骨髓源树突细胞功能及CP-25的作用

发布时间：2017-05-26 02:12

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【摘要】：前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)是一类重要的花生四烯酸类物质的代谢产物,在免疫反应中发挥重要的调节作用。PGE2受体(E-prostanoid receptors, EPs)分为4个亚型,即EP1、EP2、EP3和EP4。PGE2与其不同EP受体结合,发挥不同的生理和病理作用。树突细胞(dendritic cells, DCs)作为体内专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC),具有调节固有免疫和适应性免疫的重要作用。根据DCs在体内的状态的不同,DCs具有免疫原性和免疫耐受性双重作用,表现为成熟树突细胞(mature DCs, mDCs)显示出促进免疫作用,而未成熟树突细胞(Immature DCs, iDCs)显示出免疫耐受特性。 PGE2-EP4-Gs (stimulatory G protein)蛋白偶联信号调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平参与了炎症免疫反应。β-arrestin2与G蛋白偶联受体激酶2 (G-protein-coupled receptor kinases 2,GRK2)联合作用,引起了细胞表面受体的脱敏和受体的内吞,进而负向调控G蛋白信号通路。PGE2能促进DCs的成熟,表现为DCs摄取抗原能力降低,而抗原提呈能力增强。但PGE2对DCs的调节作用是否通过EP4-cAMP通路发挥的,以及在这个调节作用中β-arrestin及GRK发挥怎样的作用还未见报道。课题组前期报道,Pae具有抗炎和免疫调节的作用。CP-25是课题组采用酰化反应对Pae进行结构修饰,而合成的一个新的Pae单体衍生物。整体实验研究表明,CP-25明显缓解和治疗小鼠CIA,该作用与其调控T、B淋巴细胞的功能有关。CP-25对DCs的功能有无调节作用?其作用是否通过调节EP4-cAMP通路及影响P-arrestin和GRK表达?未见报道。目的：研究PGE2对骨髓源DCs功能的变化及机制,研究CP-25对PGE2作用下的骨髓源DCs功能的调节作用及部分机制,为揭示PGE2通过受体参与DCs调控的作用和机制以及CP-25的作用提供实验依据。方法：以骨髓源DCs作为研究对象,用不同浓度PGE2作为刺激因子,观察经PGE2刺激后的骨髓源DCs细胞表面EP4、细胞内cAMP、β-arresti2、GRK2的水平变化,同时观察CP-25对上述变化的影响。流式细胞术检测骨髓源DCs表型CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ表达高低和抗原摄取功能,荧光间标法检测小鼠骨髓源DCs细胞膜上EP4的表达,以平均荧光强度表示表达的高低；MTT法检测处理后的DCs对T细胞增殖的作用；放免法检测骨髓源DCs内cAMP的水平变化；westernblot法检测DCs细胞膜上GRK2和β-arrestin2蛋白表达水平。结果：1. PGE2促进DCs的成熟和升高DCs细胞膜EP4的表达PGE2(2.5、5、10nmol/L)作用于DCs 24h能明显上调DCs表面分子CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表达,对CD80表达无明显影响；PGE2(1.25、2.5、5、 10、20nmol/L)作用于DCs 24h能明显抑制DCs的抗原摄取功能；P GE2 (2.5. 5、10nmol/L)刺激DCs 24h能促进T细胞增殖的作用；PGE2(2.5、5、10nmol/L)作用于DCs 24h明显升高DCs细胞膜上EP4表达。2.CP-25通过调节EP4-cAMP通路恢复异常增高的DCs功能CP-25(10-5、10-6、10-7mol/L)作用于DCs 24h能明显下调CD40、CD83、 MHC-Ⅱ的表达；CP-25(10-5、10-6、10-7mol/L)作用于DCs 24h能恢复经PGE2刺激的DCs对T细胞增殖的作用,能明显促进DCs的抗原摄取功能；CP-25(10-5、 10-6、10-7mol/L)作用于DCs 24h明显下调PGE2升高的DCs细胞膜上EP4表达。CP-25(10-5、10-6、10-7mol/L)作用于DCs 24h上调PGE2降低的DCs内cAMP水平；CP-25 (10-6nmol/L)作用于DCs 24h对PGE2上调的DCs细胞膜上GRK2、β-arrestin2水平有明显抑制作用。结论：1.PGE2可以促进DCs成熟,表现为高表达共刺激分子、抑制DCs的抗原摄取功能、促进T细胞增殖的作用。2.PGE2促进DCs成熟可能与其调控EP4-cAMP信号转导通路有关；3.CP-25抑制PGE2所致DCs成熟可能与其恢复EP4-cAMP信号转导通路有关。
【关键词】：树突细胞 EP4受体 PGE2 CP-25 GRK2 β -arrestin2
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 英文缩略词表(Abbreviation)6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 1 前言16-18
• 2 实验材料18-20
• 2.1 实验动物18
• 2.2 药物与试剂18-19
• 2.3 仪器与设备19-20
• 3 实验方法20-28
• 3.1 骨髓源DCs分离与培养20-21
• 3.2 骨髓源DCs的鉴定21
• 3.2.1 形态学鉴定21
• 3.2.2 骨髓源DCs细胞表型鉴定21
• 3.3 骨髓源DCs的干预21-22
• 3.3.1 PGE2对骨髓源DCs的干预21-22
• 3.3.2 CP-25对骨髓源DCs的干预22
• 3.4 骨髓源DCs的表型及功能检测22-23
• 3.4.1 骨髓源DCs表型的检测22
• 3.4.2 骨髓源DCs抗原摄取能力的检测22-23
• 3.4.3 骨髓源DCs对T细胞增殖影响的检测23
• 3.5 流式细胞术检测骨髓源DCs表面上EP4的表达23
• 3.6 骨髓源DCs内cAMP水平的检测23-25
• 3.7 Western blot法检测GRK2、β-arrestin2的表达25-27
• 3.7.1 骨髓源DCs样品的制备及蛋白质的提取25
• 3.7.2 骨髓源DCs胞膜蛋白的分离25
• 3.7.3 蛋白质定量(Lowry法)25-26
• 3.7.4 Western blot操作步骤26-27
• 3.8 统计学处理27-28
• 4 结果28-54
• 4.1 PGE2对骨髓源DCs表型及功能的影响28-40
• 4.1.1 骨髓源DCs的形态学变化及流式鉴定28-29
• 4.1.2 PGE2对骨髓源DCs表面分子CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ表达的影响29-35
• 4.1.3 PGE2对DCs抗原摄取能力的影响35-37
• 4.1.4 PGE2处理的DCs对T细胞增殖的影响37-38
• 4.1.5 PGE2对骨髓源DCs表面EP4表达的影响38-40
• 4.2 CP-25对PGE2处理后的骨髓源DCs功能的影响40-54
• 4.2.1 不同浓度及刺激不同时间PGE2对DCs上CD40表达的影响40-41
• 4.2.2 CP-25对骨髓源DCs表面CD40、CD83、MHC-Ⅱ表达的影响41-46
• 4.2.3 CP-25对骨髓源DCs抗原摄取能力的影响46-48
• 4.2.4 CP-25处理骨髓源DCs对T细胞增殖的响48-49
• 4.2.5 CP-25对骨髓源DCs表面EP4表达的影响49-51
• 4.2.6 CP-25对骨髓源DCs内cAMP水平的影响51-52
• 4.2.7 CP-25对骨髓源DCs中GRK2、β-arrestin2表达水平的影响.52-54
• 5 讨论54-61
• 5.1 PGE2促进骨髓源DCs功能的变化54-57
• 5.2 PGE2促进DCs的成熟与其作用于EP4有关57-58
• 5.3 恢复PGE2-EP4-G蛋白-cAMP信号转导是CP-25调控骨髓源DCs功能的重要机制之一58-61
• 6 结论61-62
• 参考文献62-71
• 附录71-73
• 致谢73-75
• 综述：树突细胞在类风湿性关节炎病理机制中的免疫原性和耐受性双重作用75-88
• 参考文献83-88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：395556