纹状体MSNs中M4受体对cAMP/DARPP-32磷酸化信号通路的调控作用研究

发布时间：2024-05-17 03:03

　　M1和M4是纹状体内主要分布的M受体,在纹状体MSNs神经元发挥重要的调控作用,然而具体调控机制不清。DARPP-32(Dopamine-and c AMP-regulated phosphoprotein of Mr 32 k Da)是DA信号转导通路上的重要调控信号分子之一。在本实验中,我们证实了M1和M4对c AMP/DARPP-32磷酸化信号通路的调控作用。给予纹状体MSNs非选择性M受体激动剂——氧化震颤素(Oxotremorine,OX)1μM,孵育5min后,OX以一种不依赖于M受体的方式升高胞内c AMP的水平,与非选择性DA受体激动剂阿扑吗啡(Apomorphine,APO)比较研究发现作用弱于阿扑吗啡。TTX通过抑制突触前膜,诱导的胞内cAMP生成增加显著性上调。有趣的是,我们发现OX和APO对DARPP-32的磷酸化具有不同的影响。OX特异性上调DARPP-32 Thr-75位点的磷酸化,APO同时上调DARPP-32 Thr-75和Thr-34位点的磷酸化。特异性敲减M4受体或MT3药理阻断M4受体,抑制M受体激动导致的Thr75的磷酸化,实验结果表明M4受体在...

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摘要
ABSTRACT
中英文缩略词表
前言
第一部分：Chrm4-sh RNA慢病毒载体的构建包装及KD-M4 MSNs细胞模型的建立
    一、慢病毒干扰载体的构建
        材料与方法
            1 实验材料
            2 实验方法
                2.1 sh RNA靶点的选择
                2.2 sh RNA引物的设计
                2.3 RNAi慢病毒重组质粒的构建
        结果
        小结
    二、慢病毒的包装及测定病毒滴度（吉满生物）
        材料与方法
            1. 细胞株
            2. 菌株
            3. 慢病毒包装系统
            4. 试剂
            5. 仪器
            6. 实验方法
        结果
        小结
    三、KD-M4 MSNs细胞模型的建立
        材料与方法
            1 实验材料
            2 实验方法
                2.1 原代大鼠纹状体神经元培养
                2.2 细胞免疫荧光
                2.3 Western blot检测转染细胞表达情况
                2.4 Chrm4-sh RNA慢病毒载体转染纹状体MSNs
                2.5 统计学处理方法
        结果
            1 原代纹状体 MSN 神经元鉴定
            2 Chrm4-sh RNA 慢病毒载体初筛
            3 Chrm4-sh RNA2 慢病毒载体转染 MSNs
        小结
第二部分：纹状体MSNs中M4受体对c AMP/DARPP-32磷酸化信号通路的调控作用研究
    材料与方法
        1 实验材料
        2 实验方法
            2.1 细胞免疫荧光
            2.2 应用时间分辨荧光共振能量转移的检测方法（TR-FRET assay,time-resolved fluoresence resonance energy transfer assay）检测原代培养的新生大鼠纹状体神经元胞内 c AMP 含量
            2.3 大鼠纹状体神经元内 P-Thr34 Darpp-32，P-Thr75 Darpp-32，CREB 和 P35蛋白含量的测定（见第一部分实验方法 2.4）
            2.4 统计学处理方法
    结果
        1 M1 和 M4 受体表达研究
        2 应用 TR-FRET 分析检测氧化震颤素诱导胞内 c AMP 生成及调控作用
        3 氧化震颤素对 DARPP-32 P-Thr34 和 P-Thr75 的磷酸化作用
        4 氧化震颤素上调 DARPP-32 P-Thr75 磷酸化水平的调控作用研究
        5 在 KD-M4 MSNs 上氧化震颤素对 DARPP-32 P-Thr75 磷酸化作用的研究
    讨论
    结论
图及照片
参考文献
综述
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
个人简历



本文编号：3975287