以IspD为靶点的新型抗结核药物筛选研究

发布时间：2017-06-01 06:13

  本文关键词：以IspD为靶点的新型抗结核药物筛选研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)的耐药问题日趋严重,针对新靶标开发全新机制的抗结核药物是抗击耐药结核分枝杆菌的有效途径。MTB细胞壁结构独特,对于MTB的生长繁殖以及致病性至关重要。因此,MTB的细胞壁生物合成途径蕴含着大量潜在的抗结核新靶标。异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)及其同分异构体二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)是MTB细胞壁中肽聚糖层和阿拉伯半乳糖层的必须前体,2-C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)途径是MTB生物合成IPP和DMAPP的唯一途径。该途径共有8个蛋白参与催化反应,2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸-胞嘧啶转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase, IspD)是该途径的关键限速酶。本研究旨在获得靶向IspD的新型抗结核药物,并以此为探针验证IspD作为抗结核新靶标的可行性。本论文共完成了三个主要的研究内容：第一是采用MTBH37Rv的全细胞筛选模型对化合物库4万个样品进行初筛和复筛,得到159个在质量浓度为20μg/ml时能抑制MTB生长的阳性化合物,阳性率为0.4%；第二是以MTB H37Rv基因组为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增ispD基因,连接进入表达载体pET28a(+),转化E. coli BL21(DE3)pLysS,构建结核分枝杆菌2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸-胞嘧啶转移酶(Mycobacterium tuberculosis 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase, MtlspD)重组表达菌株,诱导表达和分离纯化MtIspD,建立和优化MtIspD酶活测定方法,构建MtIspD酶抑制剂筛选模型,应用该模型从具有抗结核活性的化合物中筛选得到5个MtIspD的抑制剂,其中的阳性化合物IMB-4901对MtIspD及MTB均有较强的抑制活性,对MtIspD的IC50为19.3 μg/ml,对MTBH37Rv的MIC为1.6μg/ml;酶动力学研究表明,化合物IMB-4901是底物MEP和CTP竞争性抑制剂,Ki分别为24.9μg/ml和15.1 μg/ml；抗菌谱测定结果表明,IMB-4901选择性的作用于革兰氏阳性菌,特别是对MTB有很强的选择性抑制作用；IMB-4901对非洲绿猴肾细胞(Vero)和人肝癌细胞(HepG2)有一定的毒性,其TC50分别为1.8μg/ml和1.9μg/ml；第三是以pET28a(+)::ispD为模板,克隆ispD基因的前320 bp,构建可在MTB中可控表达MtIspD的质粒,为最终获得可控表达MtlspD的MTB突变菌株,确认IMB-4901的作用靶标奠定基础。
【关键词】：结核分枝杆菌 MtIspD 抑制剂 筛选模型 药物靶标
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R978.3
【目录】：

• 缩略语表7-9
• 中文摘要9-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-16
• 实验材料与仪器16-22
• 1 菌株及细胞16
• 2 基因组和质粒16
• 3 培养基16-18
• 3.1 E.coli培养基16-17
• 3.2 分杆杆菌培养基17
• 3.3 其他菌株药敏实验所用培养基17-18
• 3.4 Vero和HepG2培养基18
• 4 主要试剂18
• 5 溶液18-20
• 5.1 抗生素溶液18-19
• 5.2 蛋白相关溶液19-20
• 6 试剂盒20-21
• 7 工具酶21
• 8 主要仪器21-22
• 实验方法22-43
• 1 基于MTB的表型筛选22
• 1.1 化合库中样品的初筛22
• 1.2 化合物样品的拆分及复筛22
• 2 MtIspD酶抑制剂的筛选22-35
• 2.1 ispD基因的扩增22-24
• 2.2 表达载体的构建24-27
• 2.3 表达菌株的构建27-28
• 2.4 MtIspD蛋白的诱导表达28
• 2.5 MtIspD蛋白纯化及蛋白质含量测定28-30
• 2.6 MtIspD蛋白的定量30
• 2.7 MtIspD蛋白的SDS-PAGE电泳检测30-32
• 2.8 MtIspD活性测定原理及方法32
• 2.9 MtIspD酶活性测定体系优化32-33
• 2.10 MtIspD抑制剂筛选模型的确立33-35
• 3 抑制剂半数抑制浓度(IC_(50))测定35
• 4 抑制剂的体外抗结核活性测定35-36
• 5 抑制剂抗菌谱活性测定36
• 6 化合物IMB-4901对MtIspD的动力学研究36
• 7 化合物IMB-4901的细胞毒性研究36-37
• 8 MtIspD可控表达菌株的构建37-43
• 8.1 构建MtIspD可控表达菌株的目的及意义37-38
• 8.2 MtIspD可控表达质粒构建流程38
• 8.3 ispD基因前320bp的获得38-39
• 8.4 PCR产物的纯化39-40
• 8.5 纯化的PCR产物双酶切处理及回收40
• 8.6 pAZI 9479的双酶切处理及片段回收40-41
• 8.7 酶切后ispD前320bp与pAZI9479连接41
• 8.8 连接产物转化DH5α感受态细胞41
• 8.9 阳性克隆鉴定41
• 8.10 阳性克隆质粒的提取41-42
• 8.11 重组质粒测序42
• 8.12 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp电转入H37Rv42-43
• 实验结果43-58
• 1 基于MTB(H37Rv)表型筛选抗结核活性化合物43
• 2 MtIspD酶抑制剂的筛选43-51
• 2.1 表达质粒pET28a(+)：：ispD的构建与验证43-45
• 2.2 MtIspD蛋白的制备45-47
• 2.3 酶活力测定47-48
• 2.4 酶活测定体系的优化48-50
• 2.5 MtIspD抑制剂筛选模型50
• 2.6 MtIspD抑制剂的筛选50-51
• 3 MtIspD抑制剂对H37Rv的最低抑菌浓度(MIC)51-52
• 4 MtIspD抑制剂的抗菌谱52-53
• 5 化合物IMB-4901对MtIspD的抑制动力学研究53-54
• 6 化合物IMB-4901对肝肾细胞毒性研究54-55
• 7 MtIspD可控表达菌株的构建55-58
• 7.1 ispD基因前320bp片段的获得55
• 7.2 纯化的PCR产物双酶切55
• 7.3 pAZI 9479的双酶切55-56
• 7.4 阳性克隆菌落PCR鉴定56
• 7.5 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp测序56
• 7.6 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp电转入H37Rv56-58
• 讨论58-60
• 结论60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-63
• 文献综述63-76
• 参考文献70-76
• 附录76-78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李薇;薛欣;楚雍烈;邱奕;宋娟;郑建武;;结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药与embB基因突变的相关性研究[J];卫生研究;2010年04期

  本文关键词：以IspD为靶点的新型抗结核药物筛选研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：411870