环磷酸腺苷在大鼠胰岛素分泌中的作用及其机制

发布时间：2017-06-01 00:13

  本文关键词：环磷酸腺苷在大鼠胰岛素分泌中的作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨腺苷酸环化酶(AC)/环磷酸腺苷(c AMP)信号转导通路在大鼠胰岛素分泌中的作用,通过使用AC激动剂Forskolin和抑制剂SQ22536研究c AMP影响胰岛素分泌的机制。方法:(1)处死大鼠,打开大鼠腹腔,将胶原酶P(Collagenase P)液从胰总管打入胰腺,可看到附着在胃和小肠的胰腺,迅速剪下胰腺,将其放到38℃水浴震荡消化11 min,采用Histopaque-1077,离心分离出大鼠胰岛。用DispaseⅡ消化胰岛,可得到大鼠原代胰岛β细胞,为了使研究结果最为接近大鼠生理状态,以上方法分得的胰岛和细胞最多使用7天。(2)DTZ染液可将胰岛染成猩红色,对其进行染色鉴定,室温下染色胰岛10分钟,在光学显微镜下观察胰岛形态。对胰岛进行活性检测可用AO/PI染液孵育胰岛,用490 nm激发光,510 nm发射光观察。(3)得到的胰岛在37℃细胞培养箱培养,用放射性免疫分析法检测AC激动剂Forskolin和抑制剂SQ22536对大鼠胰岛素分泌及环磷酸腺苷(c AMP)含量的影响。(4)采用膜片钳技术检测药物对胰岛β细胞电压依赖性钾通道(KV)、动作电位(AP)的影响。(5)采用离子成像技术检测Forskolin和SQ22536对胰岛β细胞内钙离子浓度的影响。结果:(1)用胶原酶P,Histopaque-1077梯度离心法分得的胰岛,大小不一,折光性好,直径在100-300μm。胰岛β细胞细胞呈球形,质地光滑,表面圆润。(2)胰岛经DTZ染色成猩红色,显示在以上实验中分离为胰岛,且纯度较高。95%以上的胰岛经AO/PI染色后发绿色荧光,胰岛活性好。(3)在胰岛素分泌实验中,胰岛有明显的葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用;在不同葡萄糖浓度下胰岛素分泌的标化值分别是:(1.00±0.38)用特异的AC激动剂Forskolin和广泛应用的AC抑制剂SQ22536,在8.3m M葡萄糖的基础上,Forskolin增加了胰岛素分泌(8.3 G,n=6vs8.3G+Forskolin,10μM,n=6,P0.05);(4)在有SQ2253610μ的作用下,可以阻断Forskolin增加胰岛素分泌的作用(8.3G+Forskolinvs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM,n=6,P0.05)。(5)在c AMP量检测试验中,所测c AMP值分别为2.8G组999.68±95.82fmol/10islets/hr,8.3G组1021.77±73.73fmol/10islets/hr,8.3G+SQ22536组1187.23±133.13fmol 10islets/hr,8.3G+Forskolin组3682.14±395.38fmol/10islets/hr,8.3G+SQ22536+Forskolin组2947.21±157.63 fmol/10islets/hr。Forskolin增加了胰岛β细胞内生物合成的c AMP(8.3G n=6 vs 8.3G+Forskolin,10μM,n=6,P0.01);同时c AMP的量没有影响(8.3Gvs8.3G+SQ22536,10μM,n=6,P0.05);但是SQ22536可以部分阻断Forskolin增加了胰岛β细胞内生物合成的c AMP的量(8.3G+Forskolin,10μM,n=6vs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM,n=6,P0.05)。(6)通过膜片钳实验看出,KV通道的开放可被Forskolin极大地抑制,减小KV电流,同样的情况下SQ22536对KV电流没有影响,而给予Forskolin+SQ22536加药刺激,则可以发现SQ22536部分阻断Forskolin抑制KV通道开放的作用。在80m V的刺激时,记录电流密度为Forskolin(n=6,76.67±2.78p A/p F),SQ22536+Forskolin(n=6,109.89±4.58p A/p F)与对照组(n=6,139.62±4.54p A/p F)相比明显地抑制KV电流;Forskolin(n=6,76.67±2.78p A/p)与SQ2253+Forskolin(n=6,109.89±4.58p A/p F)相比有统计学差异;而SQ22536(n=6,132.43±2.78p A/p F)对KV的影响无统计学差异。在二甲基亚砜DMSO加药组与对照组的比较中,尚未发现DMSO对KV通道有影响。(7)使用膜片钳检测动作电位时程(APD),Forskolin加药组(70.28±5.18ms,10μM,n=8)相比较对照组(40.61±3.77ms,n=8),p0.01;Forskolin+SQ22536加药组(52.73±2.19,10μM,n=8)与Forskolin加药组比较,可以减少Forskolin对动作电位的延长,p0.05。(8)在离子成像试验中得到,在低葡萄糖浓度,尚未发现Forskolin(10μM,n=8)可以使细胞内的钙离子浓度有变化。在高糖的基础上,给予Forskolin(10μM,n=8)的刺激,发现对细胞内的钙离子浓度的变化有显著影响;同样条件,先给予SQ22536(SQ,10μM,n=8)的加药刺激,未见明显变化,持续一段时间以后,接着给细胞Forskolin(FSK,10μM,n=8)的刺激。结论:(1)梯度分离法分离纯化胰岛,消化得到的胰岛β细胞状态良好。(2)实验中分得的胰岛DTZ染色显示纯度高,AO/PI染色说明活性良好。(3)在正常生理状态下,胰岛功能好。Forskolin有促胰岛素分泌作用,可被SQ22536所减弱,而SQ22536对胰岛素分泌没有影响,说明胰岛素分泌量被c AMP所增加。(4)加入药物Forskolin能使细胞内的c AMP含量明显升高,且Forskolin升高c AMP的作用可以被SQ22536削减。(5)Forskolin明显抑制KV通道,而这种作用可被SQ22536所消除,说明c AMP会影响KV通道的开放和闭合。(6)Forskolin显著延长ADP,SQ22536可以缩短Forskolin对AP时程的延长,说明增加细胞内c AMP的量可以延长APD。(7)胰岛细胞内的钙离子浓度在加入Forskolin后明显增加了,SQ22536能够消弱Forskolin升高钙离子浓度的作用。综上所述,在胰岛β细胞上通过使用AC激动剂Forskolin增加细胞内在c AMP的生物合成,c AMP可以抑制KV通道的开放,使APD作用延长,使钙离子进入到细胞内的时间延长,使细胞内的钙离子浓度显著增多,最终使胰岛素的分泌的量增加;在加入药物SQ22536,尚未发现该药其本身对胰岛素分泌及KV电流有影响,但该药可以阻断Forskolin对胰岛素分泌、c AMP的生物合成量及KV电流、ADP、细胞内钙离子浓度的作用,提示细胞内的c AMP含量的变化可以影响Kv通道、ADP、细胞内钙离子浓度,进而对胰岛素的分泌量产生影响。
【关键词】：胰岛β细胞 环磷酸腺苷 胰岛素分泌 电压依赖性钾通道 动作电位时程
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用缩写词中英文对照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-23
• 1.1 药品与试剂15
• 1.2 实验所需溶液的配置15-16
• 1.3 主要实验仪器16
• 1.4 动物16
• 1.5 分离纯化大鼠胰岛及细胞的分离与培养16-18
• 1.6 胰岛活性测定18-19
• 1.7 胰岛素分泌实验19-20
• 1.8 c AMP含量检测20
• 1.9 电生理实验---膜片钳实验20-21
• 1.10离子成像实验测定胰岛β细胞内部钙离子浓度的变化21-22
• 1.11统计处理22-23
• 2 结果23-37
• 2.1 SD大鼠胰岛的功能检测23-26
• 2.2 胰岛β细胞的分离培养26-27
• 2.3 c AMP对胰岛素分泌的影响27-29
• 2.4 c AMP影响胰岛素分泌机制的研究29-35
• 2.5 检测溶剂DMSO对胰岛β细胞上KV通道电流的影响35-37
• 3 讨论37-39
• 4 结论39-40
• 参考文献40-43
• 综述43-54
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果55-56
• 个人简历56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 宫璀璀;郑乃刚;王广兰;吴景兰;李璇;;8-Br-cAMP和槲皮素联合应用对Eca-109细胞增变基因表型的影响[J];河南医学研究;2010年03期

2 赵家伟,马凤海,罗梅,李军,邹云红,王煜,李秀钧;胰岛β细胞胰岛素抵抗的证据[J];中华内分泌代谢杂志;2005年04期

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本文编号：411074