安丝菌素固体发酵及安丝菌素P-0制备

发布时间：2017-05-31 18:23

  本文关键词：安丝菌素固体发酵及安丝菌素P-0制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：安丝菌素(ansamitocin)属于苯安莎类抗生素,具有强烈的肿瘤细胞毒性,是开发抗体药物偶联物(ADCs)的重要原料。国内安丝菌素发酵水平不高、商业供应匮乏,为我国ADC药物研发带来一定难度。将安丝菌素发酵培养、分离提取及制备进行综合考虑,以提高安丝菌素产量、降低生产成本为目标的研究,具有应用前景。医药生物技术研究所作为我国微生物药物研发机构之一,也在进行ADCs类药物的开发,并且急需稳定的安丝菌素供应。在本研究中,我们采用固体发酵珍贵束丝放线菌ATCC 31565,建立了安丝菌素发酵,提取,分离纯化的实验室制备工艺流程。首先,我们建立了适合珍贵束丝放线菌ATCC 31565稳定产生丰富孢子的种子培养基(葡萄糖：8g/L,麦芽提取物：5g/L,琼脂粉：15g/L,酵母提取物：1g/L,NaCl:5g/L)。通过摸索不同安丝菌素固体发酵培养基配方,获得了一种安丝菌素固体发酵培养基配方(葡萄糖：20g/L,玉米淀粉：30 g/L,棉籽饼粉：30g/L, CaCl2:10g/L,琼脂粉：20g/L),安丝菌素(纯度85%)产量稳定在约100mg/L,较ISP2培养基提高安丝菌素产量3倍多。在此基础上,我们对珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵培养物进行乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析,得到含安丝菌素P-2、P-3和P-4组分的混合物。参考相关文献报道,我们对安丝菌素发酵进行了一些验证和探索。例如,在培养基中添加异丁醇,提高了安丝菌素组分P-3的相对含量,但是安丝菌素总产量未见提高。在培养基中添加缬氨酸(Val)或者稀土元素钪(ScCl3),未见安丝菌素发酵水平提高；同时,我们也进行了安丝菌素液体摇瓶发酵,效价与固体发酵相当,但液体发酵液粘稠度较高,给安丝菌素的分离提取带来了一定不便。最后,通过水解反应化脱去安丝菌素P-2,P-3,P-4中的C-3酰基侧链；采用制备型HPLC获得安丝菌素P-0纯品。安丝菌素P-0得率约82%(纯度大于99%)。提供安丝菌素样品1.5g,用于医药生物技术研究所ADCs类药物的研发,解决了我所在ADCs类药物起始研发阶段对安丝菌素的迫切需求。
【关键词】：安丝菌素 抗体药物偶联物(ADCs) 珍贵束丝放线菌 固体发酵
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-9
• 前言9-18
• 安丝菌素研究现状9-13
• 安丝菌素发酵影响因素13-16
• 本课题研究目的及意义16-18
• 1 实验材料18-23
• 1.1 菌株18
• 1.2 培养基18-20
• 1.3 主要试剂20-21
• 1.4 主要仪器21-23
• 2 实验方法23-28
• 2.1 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵孢子悬液制备23
• 2.2 珍贵束丝放线菌ATCC 31565液体发酵种子制备23
• 2.3 安丝菌素TLC检测方法23
• 2.4 安丝菌素HPLC检测方法23-24
• 2.5 安丝菌素P-3标准曲线建立24
• 2.6 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵24-27
• 2.6.1 珍贵束丝放线菌ATCC 31565—ISP2培养基固体发酵24-26
• 2.6.2 珍贵束丝放线菌ATCC 31565—发酵培养基固体发酵26-27
• 2.7 珍贵束丝放线菌ATCC 31565液体发酵27
• 2.8 安丝菌素分离纯化27
• 2.8.1 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵产物提取方法27
• 2.8.2 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵产物硅胶柱层析方法27
• 2.9 安丝菌素水解反应(由合成室王玉成老师课题组完成)及P-0制备27-28
• 3 实验结果与讨论28-44
• 3.1 ISP2培养基固体发酵安丝菌素28-29
• 3.2 安丝菌素P-3标准曲线的建立29-32
• 3.3 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵培养条件优化32-35
• 3.3.1 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体种子培养基优化32-33
• 3.3.2 珍贵束丝放线菌ATCC 31565固体发酵培养基优化33-34
• 3.3.3 平皿装量优化34-35
• 3.4 安丝菌素分离纯化35-36
• 3.5 安丝菌素水解反应及P-0制备36-38
• 3.6 珍贵束丝放线菌ATCC 31565其他探索工作38-43
• 3.6.1 ISP2+Val,ISP2+ScCl_3培养基发酵产物提取分析39-40
• 3.6.2 ISP2+异丁醇培养基发酵产物提取分析40-42
• 3.6.3 液体发酵产物提取分析42-43
• 3.7 讨论与工作展望43-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-47
• 文献综述：抗体药物偶联物研究进展47-58
• 参考文献56-58
• 英文缩略语58-59
• 致谢59-60
• 个人简介60
• 硕士在读期间发表的学术论文60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李婷兰;韦柳静;范宇翔;马玉栋;白林泉;花强;;奇迹束丝放线菌合成安丝菌素过程中支链氨基酸的添加效果分析[J];华东理工大学学报(自然科学版);2013年06期

2 朱贵东;傅阳心;;设计新一代抗体药物偶联物[J];药学学报;2013年07期

3 伊丹;王岩;陈少欣;;安丝菌素P-3的发酵工艺[J];中国医药工业杂志;2012年04期

  本文关键词：安丝菌素固体发酵及安丝菌素P-0制备，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：410316