地西他滨联合三氧化二砷对HL-60细胞增殖、凋亡的作用以及对DAPK基因影响的实验研究

发布时间：2017-06-03 04:02

  本文关键词：地西他滨联合三氧化二砷对HL-60细胞增殖、凋亡的作用以及对DAPK基因影响的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,且其发病率有逐年上升的趋势。在过去的几十年里,AML的治疗已有了长足的进步,目前治疗的手段主要有联合化疗和在化疗基础上的造血干细胞移植。传统化疗的毒副作用和耐药复发严重影响着患者的总体生存率,虽然骨髓移植是根治方法,但由于人类白细胞抗原不相合性以及移植后GVHD产生的风险,故限制了其在临床的广泛开展。因此,我们需要寻找新的药物来优化治疗方案,减少药物的毒副作用以及交叉耐药,以提高患者总体生存率。目前研究发现,白血病细胞基因启动子区DNA甲基化的发生率明显增高,特别是那些具有抑癌功能的基因启动子区发生的高甲基化。与基因突变不同,DNA甲基化是一种可逆转的基因修饰过程,故在肿瘤或癌前病变中可以通过去甲基化处理恢复基因的表达,从而达到防治肿瘤的目的。因此,DNA去甲基化作用将为血液系统肿瘤的治疗提供新思路。地西他滨(decitabine,DAC),又称为5-氮杂-2’-脱氧胞苷,作为一种DNA甲基化转移酶抑制剂对AML患者包括耐药、复发患者已显示出初步的疗效。目前DAC已成功应用于多种血液系统肿瘤,但在联合应用方面的研究仍比较少。三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)是我国从中医药中发掘出来的治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)效果肯定的药物,已被美国NCCN的AML诊疗指南列为疾病持续不缓解或复发时挽救治疗的首选用药,是中西医结合治疗成功的经典例证。近年来,去甲基化药物不断应用于临床,尤其是针对不适合应用标准化疗方案诱导缓解的AML患者,然而如何提高药物疗效并减轻副作用是目前一重要课题。本实验研究DAC、AS2O3对HL-60细胞(人急性髓系白血病细胞株)增殖、凋亡的作用以及对死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因表达的影响,探讨去甲基化药物治疗AML的作用机制,旨在为今后临床用药提供更多的理论依据。方法:选取AML细胞株HL-60为研究对象,并随机分组:空白对照组,DAC单药组(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L),AS2O3单药组(1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L),DAC联合AS2O3组(40μmol/L+2.5μmol/L、80μmol/L+2.5μmol/L、40μmol/L+5μmol/L、80μmol/L+5μmol/L),DAC预处理+AS2O3组(1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)。评价不同浓度药物干预不同时间后对HL-60细胞增殖、凋亡的作用以及对DAPK基因表达水平的影响。每组实验均重复3次。1用CCK8法初筛浓度并检测不同浓度药物作用24h、48h、72h对HL-60细胞的增殖抑制率;2用流式细胞术(FCM)检测不同浓度药物作用24h、48h、72h对HL-60细胞的凋亡率;3用RT-PCR法检测不同浓度药物作用HL-60细胞72h后DAPK m RNA的表达水平;4统计学处理。结果:1 DAC、AS2O3对HL-60细胞增殖的影响1.1不同浓度的DAC、AS2O3单药对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,增殖抑制率逐渐升高。DAC对HL-60细胞增殖抑制率由(10.97±1.09)%增加到(61.95±1.24)%,AS2O3对HL-60细胞增殖抑制率由(13.81±3.09)%增加到(84.18±2.94)%。各处理组间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药能够抑制HL-60细胞增殖,并呈时间剂量依赖性。(Fig.1,Fig.2,Table 1,Table 2)1.2不同浓度的DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,增殖抑制率由(43.22±4.78)%增加到(93.12±3.71)%,各处理组较单药组比较增殖抑制率显著增加,且差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3对HL-60细胞增殖抑制作用具有协同作用。(Fig.3,Table 3)1.3经DAC(80μmol/L)预处理后,不同浓度的AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,增殖抑制率由(31.8±1.32)%增加到(91.44±0.78)%,较AS2O3单药组增殖抑制率显著增加,各处理组间以及处理组与AS2O3单药组之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以增强AS2O3对HL-60细胞的增殖抑制作用。(Fig.4,Table 4)2 DAC、AS2O3对HL-60细胞凋亡的影响2.1不同浓度的DAC、AS2O3单药对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,凋亡率逐渐升高。DAC对HL-60细胞凋亡率由(8.0±1.05)%增加到(36.6±1.35)%,AS2O3对HL-60细胞凋亡率由(10.2±1.35)%增加到(45.3±2.35)%。各处理组间以及处理组与对照组之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药能够诱导HL-60细胞凋亡,并呈时间剂量依赖性。(Fig.5,Table 5,Table 6)2.2不同浓度的DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,凋亡率由(19.6±0.56)%增加到(62.1±0.71)%,各处理组较单药组比较凋亡率显著增加,且差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3对HL-60细胞诱导凋亡具有协同作用。(Fig.5,Table 7)2.3经DAC(80μmol/L)预处理后,不同浓度的AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,凋亡率由(18.8±1.32)%增加到(71.4±0.79)%,较AS2O3单药组凋亡率显著增加,各处理组间以及处理组与AS2O3单药组之间差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以增强AS2O3对HL-60细胞诱导凋亡的作用。(Fig.5,Table 8)3 DAC、AS2O3对HL-60细胞DAPKm RNA表达的影响3.1不同浓度的DAC、AS2O3单药对HL-60细胞作用72h后,随着药物浓度的增加,DAPKm RNA的表达水平逐渐升高。DAC对DAPKm RNA的表达量由1.5±0.34增加到3.2±0.56,AS2O3对DAPKm RNA的表达量由1.2±0.50增加到3.0±0.17。各处理组间以及处理组与对照组之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药能够增加HL-60细胞DAPKm RNA的表达水平,并呈剂量依赖性。(Fig.6,Fig.7,Table 9,Table 10)3.2不同浓度的DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用72h后,随着药物浓度的增加,DAPKm RNA的表达量由3.6±0.47增加到5.2±0.25,各处理组与单药组及对照组比较,DAPKm RNA的表达量显著升高,且差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3能够增加HL-60细胞DAPKm RNA的表达水平,且两者具有协同作用。(Table 11)3.3经DAC(80μmol/L)预处理后,不同浓度的AS2O3对HL-60细胞作用72h后,随着药物浓度的增加,DAPKm RNA的表达量由2.0±0.35增加到4.5±0.18,较AS2O3单药组基因的表达水平显著升高,各处理组间以及处理组与AS2O3单药组间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以提升AS2O3对HL-60细胞DAPKm RNA的表达水平。(Table 12)结论:1地西他滨和三氧化二砷单药及联合对HL-60细胞均有抑制增殖、诱导凋亡的作用,且呈时间剂量依赖性。2地西他滨和三氧化二砷发挥作用具有协同效应。3经地西他滨预处理后,可以增加三氧化二砷对HL-60细胞的敏感性,其作用机制可能与恢复或增加了DAPK基因的表达有关,DAPK基因可能是DAC诱导HL-60细胞凋亡的调控基因之一。
【关键词】：去甲基化 地西他滨 三氧化二砷 HL-60 增殖 凋亡 DAPK
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-22
• 结果22-26
• 附图26-31
• 附表31-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-44
• 综述 去甲基化药物治疗急性髓系白血病的研究进展44-52
• 参考文献49-52
• 致谢52-53
• 个人简历53

【参考文献】

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本文编号：417194