抗CD20抗体在CHO细胞内高效表达的初步研究

发布时间：2017-06-10 12:06

  本文关键词：抗CD20抗体在CHO细胞内高效表达的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：一.慢病毒载体对抗CD20抗体2F2表达的研究慢病毒(Lentivirus)载体区别于一般地逆转录病毒载体在于,它不仅能感染分裂细胞,同时对非分裂细胞也具有很强的感染能力,它是以人类免疫缺陷型病毒HIV-1为基础,进而改造发展而成的基因表达载体。在宿主体内,慢病毒载体将病毒RNA做为模板,合成双链DNA,此后通过环化等一系列反应下,结合病毒整合酶的催化,有效地整合进入到宿主的染色体中,具有遗传特性随着基因组的分裂进而分离,故可以实现目的基因的稳定表达。并且它的感染效率更高,可以容纳大片段外源基因,生物安全性良好。慢病毒以单拷贝的形式将外源基因有效地整合到宿主的染色体中,因此避免了克隆载体重复多拷贝而引起地基因沉默等现象,并且根据筛选基因的不同,可选用其他筛选方式,避免了使用抗生素筛选引起地长期选择过程中的目的基因的丢失,缩短了时间降低了成本。不仅如此,通过包装得到的假病毒颗粒还可以进行反复感染的操作,以增加进入宿主细胞染色体中的外源基因的数目。因此本实验尝试采用慢病毒载体过表达抗CD20抗体2F2,实验结果表明初次感染慢病毒载体后,ELISA检测O0450值时大多为假阳性的细胞株,最高值只有0.149,通过反复感染假病毒后,不仅大幅度的提高了感染效率,减少了假阳性概率,而且ELISA检测OD450值最高可达0.521。由此,我们得出结论：利用慢病毒载体过表达抗CD20抗体2F2,利用假病毒颗粒反复感染CHO细胞,可在一定程度上提高抗CD20抗体2F2在CHO细胞内的表达水平。二.探索应用高通量分选技术对提高抗CD20抗体表达量的影响因为存在“位置效应”和目的基因整合进入宿主细胞基因组中拷贝数的不同,外源基因整合入宿主细胞的基因组后,各个细胞株之间的表达水平存在着显著的差异。有研究表明,在整个混合克隆中仅有少于1%的高表达的细胞克隆株,因此要从上万各细胞中挑选出符合要求的高表达细胞株,工作量繁杂且结果不理想。荧光激活细胞分选器,又称为流式细胞分选仪(flow cytometer, FCM),它是一台集光电测量技术、单克隆抗体技术和电子生物技术为一体的先进检测仪,每秒可分析上万细胞,能够快速地检测细胞的体积、DNA水平、RNA水平、蛋白质表达等化学和物理性质,并且可对需要的细胞株进行分析分选,具有多指标测量、快速检测、多数据大量采集、可对需要的生物颗粒或细胞株分选等特点。依据每个细胞的荧光特征和光散射,流式细胞分选仪从细胞群众将特定的细胞快速分离出来。本实验的设计思路是通过分析细胞内报告蛋白(GFP)表达水平,进而间接分析抗CD20抗体2F2表达量的策略。绿色荧光蛋白(GFP)是一类重要的报告基因,不需要其它酶、底物或辅因子的参与即可自然发光,是一种从水母中分离出来的天然荧光蛋白质。利用双顺反子载体将报告基因与抗CD20抗体体基因共表达,再采用流式细胞分选仪检测荧光强度,分选高表达报告基因的细胞株,从而获得阳性克隆的目的细胞。结果显示,利用流式细胞分选得到的阳性细胞群,再单克隆化操作后ELISA同步检测,OD450最大值为0.819,将传统的有限稀释法作为对照组,对照组O0450最大值仅为0.679,因此,我们得出结论,应用流式细胞分选的方法可以提高抗体表达量。三.控制轻重链比例对CHO细胞表达抗CD20抗体的影响众所周知,抗体是由四条多肽链构成的对称结构,重链(H链)是其中两条相对分子量较大且较长的相同多肽链；而轻链(L链)则是两条相对分子量较小且较短的相同多肽链。抗体重链结合蛋白(BiP)在内质网中与抗体轻链多肽短暂的结合后,轻链可以聚合二聚体的形式分泌到细胞胞外。与抗体轻链组装成四聚体前,抗体重链多肽将与BiP持续保持结合状态,并且在缺乏抗体轻链多肽的前提下,重链最终将无法分泌到细胞胞外,细胞内的蛋白酶体会降解无法分泌到细胞胞外的重链多肽,这样就降低了全抗体的单位生产率。因此,有学者认为过量的轻链多肽对于提高抗体表达量是至关重要的。然而传统的抗体制备过程中,人们将抗体轻重链基因分别克隆在两个相同的质粒载体上,表达抗体蛋白,然而这种方法存在着轻重链比例不可控等缺点。因此,本实验采用内部核糖体进入位点(IRES)将轻重链基因克隆至实验室已构建的高表达载体GC-rich载体上,通过转染G418筛选三周后,利用有限稀释法随机克隆,同时将共转染的载体作为对照组,与对照组进行同步比较,结果显示ELISA同步检测,使用IRES挑取的克隆阳性率为67.7%(65/96),OD450最大值为0.835；虽然对照组的克隆阳性率大致相同为70.8%(68/96),但ELISA同步检测,OD450最大值为0.679；且利用内部核糖体进入位点(IRES)调控轻重链比例所得到的阳性克隆的OD450普遍高于对照组。由此,我们得到以下结论：控制轻重链比例在可提高抗CD20抗体2F2在CHO细胞内的表达水平。
【关键词】：哺乳动物细胞 抗体 慢病毒 高通量分选 双顺反子
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R917
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文缩略词表12-16
• 第一章 绪论16-23
• 1 单克隆抗体16-18
• 2 哺乳动物细胞表达系统18-19
• 3 慢病毒载体对于抗CD20抗体2F2的研究19-20
• 4 高通量分选技术对抗CD20抗体表达量的研究20
• 5 轻重链基因比率在哺乳动物细胞表达系统中的应用20-22
• 6 本研究主要创新点22-23
• 第二章 慢病毒载体对全人源抗CD20抗体2F2的研究23-40
• 2.1 前言23
• 2.2 实验材料及基本操作23-32
• 2.2.1 材料与试剂23-24
• 2.2.2 实验菌株和细胞24
• 2.2.3 实验仪器24-25
• 2.2.4 相关溶液的配制25-29
• 2.2.5 基本操作29-32
• 2.3 实验步骤和方法32-34
• 2.3.1 慢病毒载体的构建32-33
• 2.3.2 慢病毒载体的包装33
• 2.3.3 经包装的慢病毒颗粒感染CHO靶细胞33-34
• 2.3.4 病毒颗粒二次、三次、四次感染CHO靶细胞34
• 2.3.5 稳定单克隆细胞株的筛选34
• 2.4 实验结果34-38
• 2.4.1 慢病毒表达载体构建34-36
• 2.4.2 经包装的慢病毒颗粒感染CHO细胞36
• 2.4.3 慢病毒颗粒多次感染CHO细胞结果比较36-37
• 2.4.4 克隆筛选37-38
• 2.5 讨论38-40
• 第三章 应用高通量分选方法筛选表达抗CD20抗体细胞株40-63
• 3.1 前言40
• 3.2 实验仪器和实验试剂40-42
• 3.2.1 细胞和试剂40
• 3.2.2 实验仪器40-41
• 3.2.3 相关溶液配制41
• 3.2.4 基础操作41-42
• 3.3 实验方法42-52
• 3.3.0 重组表达质粒p-H-IRES-YFP和p-L-IRES-GFP的构建42-48
• 3.3.1 高表达载体pMH3-H-IRES-YFP和pMH3-L-IRES-GFP的构建48-51
• 3.3.2 脂质体转染CHO细胞及二次转染51
• 3.3.3 药物筛选及流式细胞分选51-52
• 3.4 实验结果52-62
• 3.4.1 真核表达载体的构建52-55
• 3.4.2 脂质体转染以及脂质体二次转染实验55-57
• 3.4.3 G418筛选实验57-58
• 3.4.4 流式细胞仪分选实验58-59
• 3.4.5 单克隆筛选实验59-60
• 3.4.6 FACS~((+))及FACS~((-))结果比较60-61
• 3.4.7 抗CD20抗体2F2的表达与纯化61-62
• 3.5 讨论62-63
• 第四章 抗体轻重链比应用于提高CHO细胞表达全人源化抗CD20抗体2F2的研究63-73
• 4.1 前言63-64
• 4.2 实验材料及基本操作64
• 4.2.1 材料与试剂64
• 4.2.2 实验菌株和细胞64
• 4.2.3 实验仪器64
• 4.2.4 相关溶液的配制64
• 4.2.5 基本操作64
• 4.3 实验步骤与方法64-67
• 4.3.1 重组表达质粒p-L-IRES-H的构建64-66
• 4.3.2 脂质体转染CHO细胞66-67
• 4.3.3 药物筛选及稳定单克隆株挑取67
• 4.4 实验结果67-71
• 4.4.1 真核表达载体构建67-69
• 4.4.2 单克隆筛选实验69-70
• 4.4.4 IRES~((-))真核表达载体与IRES~((+))真核表达载体的比较70-71
• 4.5 讨论71-73
• 结论73-74
• 参考文献74-81
• 综述 CHO细胞中抗体的高表达的策略81-93
• References88-93
• 作者简历及在读期间主要研究成果93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 周宏;刘志刚;孙志伟;俞炜源;;CHO/dhfr~-细胞定点整合高效表达系统的建立[J];生物工程学报;2007年04期

2 黄立强,孙奋勇,林珊莉,吴翠玲;动物细胞双顺反子高效稳定表达系统建立[J];中国生物工程杂志;2004年10期

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本文编号：438416