南极海洋芽孢杆菌多肽PBN11-8的分离纯化及抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-06-11 13:09

  本文关键词：南极海洋芽孢杆菌多肽PBN11-8的分离纯化及抗肿瘤活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肿瘤是全球危害人类健康的最严重的疾病之一,抗肿瘤药物具有巨大的市场需求,抗肿瘤先导化合物的发现具有重要意义。极地是一个潜在、重要的微生物资源库,是产生新型生物活性物质和先导化合物的微生物潜在种源地。我们从南极不同站点采集的表层海水中分离获得了大量微生物,以人肝癌细胞BEL-7402为模型,采用MTT活性跟踪法,对获得的微生物的代谢产物进行抗肿瘤活性的筛选,结果发现菌株N11-8的发酵代谢产物的抑制率达到68.1%。通过16S rRNA的序列分析和生理生化特征试验,初步确定了N11-8菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。随后,采用MTT活性跟踪法和SDS-PAGE凝胶电泳检测,通过超滤,硫酸铵沉淀,强阴离子交换层析,高效液相层析,从南极海洋芽胞杆菌N11-8的发酵液中分离纯化得到了一种具有抗肿瘤活性的多肽PBN11-8 (Peptide from Bacillus sp. N11-8),采用质谱确定其分子量为19kDa,测定多肽N端15个氨基酸的序列是ASTGSQKVTVYAVAD. MTT法检测发现PBN11-8对人肝癌细胞BEL-7402、人肾透明细胞腺癌细胞786-0、人卵巢癌细胞NIH:OVCAR-3和人大细胞肺癌细胞NCI-H460均具有较好的增殖抑制作用,IC50值分别为1.56、1.80、1.81和2.31μg/mL,但对人正常肝细胞L-02的增殖抑制作用相对较小；通过相差显微镜观察,PBN11-8可以使BEL-7402细胞变圆,细胞体积皱缩变小,细胞间连接减少,最终导致细胞大部分脱落,细胞数量减少,并且随着时间增加作用增强；通过细胞划痕实验和Transwell实验验证了PBN11-8能够抑制BEL-7402细胞的迁移与侵袭。本研究分离的南极海洋微生物将为海洋活性化合物的发现提供新的南极微生物种质资源；从海洋芽孢杆菌N11-8的代谢产物中纯化的活性多肽PBN11-8有望成为一种新的抗肿瘤先导化合物,具有较好的应用开发前景。
【关键词】：南极海水 海洋细菌 筛选 多肽 抗肿瘤活性 分离纯化
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96;R915
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 引言9-11
• 第1章 绪论11-23
• 1.1 海洋抗肿瘤药物11-17
• 1.1.1 海洋药物概述11-12
• 1.1.2 抗肿瘤药物的研究进展12-13
• 1.1.3 海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究进展13-14
• 1.1.4 海洋细菌是开发新型抗癌药物的新来源14-17
• 1.2 天然抗肿瘤药物的研究方法17-20
• 1.2.1 抗肿瘤药物筛选的有效性研究17-18
• 1.2.2 活性物质的纯化与检测18-20
• 1.3 抗肿瘤药物作用机理20-22
• 1.3.1 以细胞凋亡为靶点20
• 1.3.2 以肿瘤新生血管为靶点20
• 1.3.3 MAPK信号通路20-21
• 1.3.4 微管抑制剂21-22
• 1.3.5 端粒酶22
• 1.4 选题的目的与研究内容22-23
• 第2章 南极抗肿瘤微生物的筛选及菌种鉴定23-33
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 实验材料23
• 2.1.2 试验试剂23-24
• 2.1.3 培养基24
• 2.1.4 实验仪器24-25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 南极抗肿瘤微生物的筛选25-26
• 2.2.2 南极抗肿瘤微生物的菌种鉴定26-27
• 2.3 结果与分析27-31
• 2.3.1 南极抗肿瘤微生物的筛选结果27-28
• 2.3.2 菌株N11-8的菌种鉴定28-31
• 2.4 讨论31-33
• 第3章 南极海洋芽孢杆菌多肽PBN11-8的分离纯化33-47
• 3.1 材料33-35
• 3.1.1 实验材料33
• 3.1.2 试验试剂33
• 3.1.3 培养基33-34
• 3.1.4 溶剂34
• 3.1.5 实验仪器34-35
• 3.2 方法35-39
• 3.2.1 南极海洋芽孢杆菌N11-8的发酵培养35
• 3.2.2 超滤处理35
• 3.2.3 硫酸铵沉淀处理35-36
• 3.2.4 离子交换色谱分离36
• 3.2.5 制备型高效液相色谱分离36-37
• 3.2.6 高效液相色谱检测分离多肽的纯度37
• 3.2.7 SDS-PAGE检测分离多肽的纯度37-38
• 3.2.8 ESI质谱检测分离多肽的分子量38
• 3.2.9 分离多肽的N-端氨基酸序列的测定38-39
• 3.3 结果与分析39-43
• 3.3.1 超滤得到活性组分39
• 3.3.2 硫酸铵沉淀得到活性组分39
• 3.3.3 离子交换色谱分离获得活性组分39-40
• 3.3.4 制备型高效液相色谱分离获得的活性组分40-41
• 3.3.5 高效液相色谱对PBN11-8的纯度检测41-42
• 3.3.6 SDS-PAGE对PBN11-8的纯度检测42-43
• 3.3.7 ESI质谱对PBN11-8的分子量测定43
• 3.3.8 PBN11-8的N端氨基酸序列测定结果43
• 3.4 讨论43-47
• 第4章 PBN11-8的抗肿瘤活性47-57
• 4.1 材料47-48
• 4.1.1 实验材料47
• 4.1.2 实验试剂47-48
• 4.1.3 实验仪器48
• 4.2 方法48-50
• 4.2.1 PBN11-8对人肝癌细胞BEL-7402增殖的抑制作用48
• 4.2.2 PBN11-8对人卵巢癌细胞NIH：OVCAR-3增殖的抑制作用48
• 4.2.3 PBN11-8对人肾透明细胞腺癌细胞786-0增殖的抑制作用48-49
• 4.2.4 PBN11-8对人大细胞肺癌细胞NCl-H460增殖的抑制作用49
• 4.2.5 PBN11-8对人正常肝细胞L-02增殖的抑制作用49
• 4.2.6 PBN11-8对BEL-7402细胞形态变化的影响49
• 4.2.7 PBN11-8对BEL-7402细胞迁移和侵袭的影响49-50
• 4.3 结果与分析50-55
• 4.3.1 PBN11-8抑制BEL-7402的细胞增殖50-51
• 4.3.2 PBN11-8抑制NIH：OVCAR-3细胞增殖51
• 4.3.3 PBN11-8对786-0的细胞增殖有抑制作用51-52
• 4.3.4 PBN11-8对NCl-H460的细胞增殖有抑制作用52
• 4.3.5 PBN11-8对人正常肝癌细胞L-02的增殖抑制作用相对较小52-53
• 4.3.6 PBN11-8改变BEL-7402的细胞形态53-54
• 4.3.7 PBN11-8抑制BEL-7402的细胞迁移和侵袭54-55
• 4.4 讨论55-57
• 本文结论57-59
• 参考文献59-63
• 附录63-67
• 1. 细胞的复苏63
• 2 细胞传代培养63
• 3 细胞计数63-64
• 4. 抗肿瘤活性检测(MTT)64
• 5. 蛋白多肽浓度测定64-67
• 致谢67-69
• 攻读学位期问发表学术论文目录69-73

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