猪与牛来源肝素制备低分子肝素的比较研究

发布时间：2017-06-12 00:07

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【摘要】：20世纪末,欧洲地区暴发“疯牛病” (Bovine spongiform encephalopathy, BSE)导致大部分国家药典规定禁止使用牛来源肝素生产肝素类药物。就目前临床药用肝素类药物而言,其原料种属来源仅依赖于猪,并且中国是世界上养猪数量最多的国家,其肝素原料产量约占全球的60%,这种单一的动物种属来源与原料来源的不均衡已构成肝素类药物市场不稳定的最大潜在因素。肝素药物在临床治疗过程中会产生一些副作用,后来发现其经降解制备得到的低分子量肝素(Lowmolecular weight heparin, LMWH)I临床治疗副作用小且抗凝血效果更好。目前LMWH已成为抗血栓临床治疗最主要的药物,其中依诺肝素钠是应用最广的一种LMWH。另一方面,“疯牛病”的发病机理已被研究确认以及其扩散也得到有效控制。据联合国粮农组织(United Nations Food and Agriculture Organization, UNFAO)报告显示,世界范围内牛的数量比猪的数量高约70%,且主要分布于南美与南亚,恰好与猪的地理分布形成互补。种种因素均促使牛成为LMWH新物种来源的首选。本论文中采用猪肠和牛肺来源肝素作为原料,主要通过调节肝素苄基酯碱解的时间、温度与加碱量等工艺参数分别制备依诺肝素钠,直至满足美国药典(United States Pharmacopeia, USP)对依诺肝素钠分子量分布和1,6-内醚含量的要求。然后应用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)、液质联用法(Liquid chromatography-Mass spectrometry, LC-MS)、核磁共振波谱法(Nuclear magnetic resonance, NMR)等分析技术表征对比USP依诺肝素钠标准品与实验室制备的猪肠和牛肺来源依诺肝素钠的结构与活性的差异。该实验首次实现了对牛肺来源依诺肝素钠的糖链组成成分定性和定量分析。通过牛肺来源的依诺肝素钠与USP标准品的比较分析,可评估其作为临床抗凝血药物的发展潜力。通过此研究建立了两种属来源依诺肝素钠的制备工艺体系与质量评价体系。
【关键词】：肝素 低分子肝素 美国药典 猪肠 牛肺 液质联用 核磁
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略符号说明9-11
• 第一章 前言11-27
• 1.1 肝素的结构和功能11-12
• 1.2 肝素类药物的发展历史12-14
• 1.3 “疯牛病”的研究进展14-15
• 1.4 牛肝素类药物的发展潜力15-17
• 1.5 LMWH的种类与制备方法17-21
• 1.5.1 β-消除降解法18-19
• 1.5.2 硝酸降解法19-20
• 1.5.3 肝素酶降解法20
• 1.5.4 过氧化物降解法20-21
• 1.6 LMWH分析方法21-25
• 1.6.1 聚丙烯酰氨凝胶电泳法22
• 1.6.2 毛细管电泳法22-23
• 1.6.3 高效液相色谱法23-24
• 1.6.4 核磁共振波谱法24
• 1.6.5 质谱法24-25
• 1.6.6 生物信息学25
• 1.7 本课题的创新点和研究意义25-27
• 第二章 猪肠与牛肺来源依诺肝素钠的制备27-37
• 2.1 引言27
• 2.2 实验材料27-29
• 2.2.1 实验仪器27-29
• 2.2.2 实验试剂29
• 2.3 实验方法29-33
• 2.3.1 肝素来源验证29-30
• 2.3.2 猪肠与牛肺来源肝素分子量检测30
• 2.3.3 猪肠与牛肺来源肝素生物活性检测30-31
• 2.3.4 依诺肝素钠制备工艺31-33
• 2.4 实验结果分析与讨论33-37
• 2.4.1 肝素来源PCR结果分析33
• 2.4.2 猪肠与牛肺来源肝素的分子量分析比较33-34
• 2.4.3 猪肠与牛肺来源肝素活性对比分析34-35
• 2.4.4 工艺优化与依诺肝素钠制备35-37
• 第三章 猪肠与牛肺来源依诺肝素钠的比较分析37-58
• 3.1 引言37
• 3.2 实验材料37-40
• 3.2.1 实验仪器37-38
• 3.2.2 实验试剂38-40
• 3.3 实验方法40-45
• 3.3.1 分子量分布与1,6-内醚含量测定40-43
• 3.3.1.1 分子量分布检测40-41
• 3.3.1.2 1,6-内醚含量测定41-43
• 3.3.2 NMR结构检测43
• 3.3.3 完整糖链LC-MS指纹图谱检测43-44
• 3.3.4 生物活性检测44-45
• 3.4 实验结果分析与讨论45-58
• 3.4.1 分子量分布与1,6-内醚含量对比分析45-52
• 3.4.2 NMR检测对比分析52-55
• 3.4.3 完整糖链LC-MS指纹图谱对比分析55-57
• 3.4.4 生物活性检测对比分析57-58
• 第四章 结论58-59
• 参考文献59-65
• 致谢65-66
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及申请的专利66-67
• 学术论文评阅及答辩情况表67

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