人血白蛋白优势抗原表位的筛选及其在检测中的应用

发布时间：2017-06-12 13:09

  本文关键词：人血白蛋白优势抗原表位的筛选及其在检测中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人血白蛋白主要由人体肝脏产生,系血液中含量最高的蛋白质,是维系人体血液与组织间动态平衡的关键物质,故其制品被广泛地应用于临床多种疾病的治疗,系“救命药”之一。目前临床应用的人血白蛋白制品为注射剂(包含注射液和冻干粉),系以健康人血浆为原材料,经低温乙醇法分离、纯化并灭活病毒后制备而来。近年,人血白蛋白生产原料(健康人血浆)紧缺,无法满足生产需求,造成临床人血白蛋白注射液供应严重不足的现状,也驱动了不法者铤而走险,通过假冒人血白蛋白来谋取非法暴利。由于假冒事件的频发,危害触目惊心,已严重威胁到人民群众的用药安全。多年来,制假者的制假手段不断翻新,前期主要以化学成分冒充血液制品,目前已有以其他种属来源的白蛋白冒充人血白蛋白的趋势,而可用于其鉴别的专属、有效、快速的关键性方法尚无,无法实现其真伪的快速甄别,给临床用药带来巨大的安全隐患。本课题旨在发展并建立人血白蛋白快速甄别的有效专属的关键性新方法。本研究在对人血白蛋白优势抗原表位进行筛选的基础上,利用分子生物学技术,通过人工抗原合成和抗体构建等系列研究,建立了可用于人血白蛋白快速甄别检测的新方法,相关研究成果在国内外尚未见报道,具有显著的创新性和实用性。研究首先从基因序列入手,使用Biosun软件分别对与人白蛋白编码序列非常相似的猪,马,牛,羊白蛋白同时进行B细胞线性抗原表位的预测,同时ClustalX对其序列差异性及同源性进行比较,从中筛选三段抗原表位进行克隆表达即126-162,314-355,373-424位氨基酸。采用中心模板法设计引物,PCR合成目的基因,与PGEX-4T-2载体连接后插入大肠杆菌HB101中IPTG诱导表达,产物由SDS-PAGE电泳进行初步鉴定后,测序法对序列正确性进行验证,GST融合蛋白纯化柱纯化后获得目的蛋白。对得到的目的蛋白通过间接ELISA法与人白蛋白抗体反应,对其抗原性进行筛选;同时与猪,马,牛,羊白蛋白抗体进行交叉反应,对其特异性进行筛选。将含有人白蛋白特异性抗原表位的重组抗原与人白蛋白通过免疫反应制备得到兔多抗,辛酸-硫酸铵沉淀法纯化血清得到抗体,通过IC50和Kids两参数对两种抗体的特异性和亲和力进行评价。将人白蛋白单抗作为包被单抗,实验制备得到的多抗为酶标二抗,建立一种可用于人白蛋白定性及定量检测的双抗体夹心ELISA体系。分子克隆制备基因目的片段,PCR产物回收并酶切后经DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定,分别在110,130,150bp处有目的条带,与载体连接后转化至大肠杆菌HB101中,诱导表达产物的SDS-PAGE鉴定结果显示,在30.1,30.6,31.7 kD分子量位置得到目的蛋白产物。经间接ELISA法检测可得,373-424位人白蛋白氨基酸序列为优势抗原表位序列,该表位所得到的抗体与人白蛋白抗体的IC50分别为1.635μg·mL-1,3.280μg·mL-1,Kids分别为2.438×10-11,4.211×10-10,即说明优势抗原表位所制备的抗体特异性较高、亲和性良好,基于此抗体建立的人白蛋白检测体系可用于其定性定量检测。综上所述,本研究在编码人白蛋白的609个氨基酸序列中,成功筛选得到了特异性抗原表位序列,并通过原核表达技术和体外免疫技术成功制备得了到针对特异性抗原表位的目的蛋白和多克隆抗体,建立了可用于人血白蛋白定性、定量的ELISA检测体系,方法专属、快速、有效,对于人血白蛋白制品的应用质量安全保障具有重大意义。
【关键词】：人血白蛋白 抗原表位 基因克隆表达 间接ELISA 定性检测 定量检测
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R927
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 英文缩写9-10
• 前言10-15
• 材料与方法15-29
• 结果29-34
• 附图34-42
• 附表42-46
• 讨论46-49
• 结论49-50
• 参考文献50-56
• 综述 生物制品常用辅料及其限量检测方法研究进展56-77
• 参考文献68-77
• 致谢77-78
• 个人简历78

【参考文献】

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  本文关键词：人血白蛋白优势抗原表位的筛选及其在检测中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：444120