以CVB3-3C为靶点的药物筛选和结晶学研究

发布时间：2017-06-14 16:09

  本文关键词：以CVB3-3C为靶点的药物筛选和结晶学研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,病毒性心肌炎严重危害人类健康,抗病毒性心肌炎药物的设计和筛选对治疗该病尤为重要。B3型柯萨奇病毒(CVB3)是引起人类病毒性心肌炎最主要的病原体,其基因组只有一个开放阅读框,编码形成4个病毒衣壳蛋白(VP1-VP4)和7个非结构蛋白(2A-2C、3A-3D)。其中3C蛋白是柯萨奇病毒的一种自身水解蛋白酶,主要负责对大多数前体蛋白进行剪切,形成成熟蛋白,同时它对病毒RNA的复制,蛋白引物的形成也至关重要,对病毒的繁殖扩增极其重要,被认为是抗病毒药物设计的一个重要靶点。本论文首先使用原核表达体系实现CVB3-3C蛋白酶体外重组表达,依次经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析,获得高纯度CVB3-3C蛋白。为了实现针对CVB3-3C蛋白的药物筛选,我们通过优化实验确定了CVB3-3C蛋白药物筛选所需的缓冲液的类型、盐离子浓度及pH,并对体系中蛋白酶浓度、底物浓度及CVB3-3C蛋白酶对DMSO耐受浓度进行了优化；同时,进一步对体系的稳定性、可靠性进行分析评价,建立起一套完整的CVB3-3C蛋白药物筛选体系。利用该体系对2000多种化合物进行了筛选,共得到12种抑制率超过80%的化合物。其中6种化合物抑制效果较好,分别为：MDCE-10aIC50为36.70 μmol/L, MDCE-10c IC50为33.25μmol/L, MDCE-10e IC50为21.07 μmol/L, MDCE-A008 IC50为60.60 μmol/L, MDCE-A022 IC50为23.55 μmol/L, MDCE-A043 IC50为105.70μmol/L。用筛选得到的化合物与CVB3-3C蛋白酶进行共晶实验和药物浸泡实验,获得CVB3-3C蛋白酶与抑制剂的复合物晶体。利用X-衍射技术对复合物晶体进行分析,获得了CVB3-3C蛋白酶与化合物MDCE-A008的复合物晶体,分辨率为2.4 A。本论文在分子水平上建立起以CVB3-3C为靶点的药物筛选体系,并应用该体系筛选有效抑制剂,作为抗CVB3药物的目标化合物。同时,利用蛋白质结晶技术获得CVB3-3C蛋白酶与抑制剂的复合物晶体,为复合物进行结构解析以及CVB3药物目标化合物的改良提供数据支持。
【关键词】：柯萨奇病毒 病毒性心肌炎 药物筛选 抑制剂 结晶
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R94
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 主要符号表8-9
• 1 前言9-19
• 1.1 柯萨奇病毒与病毒性心肌炎9-12
• 1.1.1 柯萨奇病毒心肌炎的发病机制9-10
• 1.1.2 柯萨奇病毒心肌炎的诊断方法10-11
• 1.1.3 柯萨奇病毒心肌炎的治疗方法11-12
• 1.2 B3型柯萨奇病毒的3C蛋白及其他蛋白12-15
• 1.2.1 柯萨奇病毒基因组结构特征12
• 1.2.2 CVB3-3C蛋白的结构研究12-14
• 1.2.3 CVB3-3C蛋白酶的功能研究14
• 1.2.4 B3型柯萨奇病毒的其他蛋白14-15
• 1.3 针对CVB3-3C蛋白酶的药物研究15-17
• 1.3.1 以3C蛋白酶为靶点的药物研究现状15-16
• 1.3.2 以3C蛋白酶为靶点的药物筛选16-17
• 1.3.3 3C蛋白的结晶17
• 1.4 研究的内容、目的及意义17-19
• 1.4.1 研究内容17
• 1.4.2 研究目的及意义17-19
• 2 材料与方法19-39
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 菌株、基因及载体19
• 2.1.2 实验试剂19-20
• 2.1.3 实验仪器和设备20
• 2.2 实验方法20-39
• 2.2.1 培养基及缓冲液配制20-23
• 2.2.2 CVB3-3C蛋白酶的理化性质分析23
• 2.2.3 CVB3-3C体外重组体系的构建23-28
• 2.2.4 CVB3-3C蛋白的表达与纯化28-30
• 2.2.5 基于CVB-3C蛋白酶药物筛选体系的建立及应用30-36
• 2.2.6 CVB3-3C与抑制剂复合物的结构研究36-39
• 3 实验结果与讨论39-59
• 3.1 CVB3-3C蛋白的基本信息39-40
• 3.1.1 CVB3-3C蛋白的基因序列和氨基酸序列39
• 3.1.2 CVB3-3C蛋白的理化信息39-40
• 3.2 CVB3-3C体外重组体系的构建40-42
• 3.2.1 目的基因扩增和载体的制备40-41
• 3.2.2 重组质粒鉴定41-42
• 3.3 CVB3-3C蛋白的表达结果42-45
• 3.3.1 CVB3-3C蛋白的试表达结果42
• 3.3.2 CVB3-3C蛋白的亲和层析结果42-43
• 3.3.3 CVB3-3C蛋白的阴离子交换层析结果43-44
• 3.3.4 CVB3-3C蛋白的分子排阻层析结果44-45
• 3.4 筛药体系的建立45-53
• 3.4.1 CVB3-3C蛋白酶活性测定45-46
• 3.4.2 酶活缓冲液对CVB3-3C蛋白酶活性的影响46-49
• 3.4.3 DMSO对CVB3-3C蛋白酶活性的影响49-50
• 3.4.4 蛋白酶及底物浓度的确定50-52
• 3.4.5 药物筛选体系的评价52-53
• 3.5 CVB3-3C蛋白酶抑制剂的筛选53-55
• 3.6 CVB3-3C与抑制剂复合物的结构研究55-59
• 3.6.1 CVB3-3C蛋白的结晶56
• 3.6.2 CVB3-3C与抑制剂的复合物晶体56-59
• 4 结论59-60
• 5 展望60-61
• 6 参考文献61-69
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况69-70
• 8 致谢70

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本文编号：449912