基于构象表位印迹策略的肿瘤靶向纳米载体研究

发布时间：2017-06-14 21:03

  本文关键词：基于构象表位印迹策略的肿瘤靶向纳米载体研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：分子印迹技术是指在印迹材料的合成中构建与模板分子在大小、形状和结构上都互补的特异性结合位点的技术。现分子印迹技术在小分子印迹技术方面已成熟并实现商品化,但在蛋白质分了印迹技术方面却存在诸多挑战。这是因为传统的蛋白质分子印迹过程中具有蛋白质其理化性质及构效关系等因素、生产成本高等缺点,限制了其应用。现行的靶向给药系统的研究模式是通过膜蛋白的天然配体(如多肽、核酸适配体等)作为导向分子,并将其偶联于载体表面以发挥导向功能,但天然配体存在体内外稳定性差、免疫原性等问题,限制了靶向效率。基于此,本课题将蛋白质分子印迹技术和靶向给药系统相结合,提出一种构象表位印迹策略,设计与膜蛋白胞外区构象表位具有相似结构、核心序列一致的多肽,以该多肽为模板开展分子印迹,印迹形成的“空穴”对模板具有特异性结合,所制备的印迹聚合物纳米粒能特异性靶向识别肿瘤表面特定的膜蛋白,且在生理条件下比较稳定。本课题第部分探索构象表位印迹策略的可行性。采用反相微乳液聚合法,以丙烯酰胺为功能单体、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、蜂毒明肽(α螺旋结构,apamin)与其线性衍生物(其中四个半胱氨酸均被丙氨酸取代,linear apamin)为模板分子开展分子印迹,分别得到蜂毒明肽印迹聚合物纳米粒(A-MIPNPs)与线性蜂毒明肽印迹聚合物纳米粒(L-MIPNPs),采用粒度仪测定其粒径大小适宜,分散均匀；透射电镜观察显示该纳米粒的外观形态圆整,与粒度仪测定结果一致。上述两种表征结果均提示印迹聚合物纳米粒成功构建。印迹聚合物纳米粒对模板分子的结合能力实验显示与L-MIPNPs、非印迹聚合物纳米粒(NIPNPs)相比,A-MIPNPs对模板apamin具有更好的选择识别能力。纳米粒中和蜂毒明肽及其胶束实验显示A-MIPNPs能将大部分蜂毒明肽及其胶束结合进入肝脏部位,而使蜂毒明肽及其胶束在脊髓部位的蓄积量减少；L-MIPNPs与NIPNPs则没有与大部分蜂毒明肽及其胶束结合,蜂毒明肽及其胶束仍富集于脊髓部位。结果表明A-MIPNPs能中和小分子蜂毒明肽甚至其大分子胶束。上述研究显示与线性蜂毒明肽印迹聚合物相比,蜂毒明肽印迹聚合物纳米粒对模板apamin具有更强的结合能力,即以具有高级结构的多肽为模板的印迹聚合物比以具有线性结构的多肽为模板的印迹聚合物对模板分子的亲和力更高,表明在一级序列相同时,印迹模板多肽的高级结构对印迹效果起关键作用。此外,我们初步掌握了构建印迹聚合物纳米粒的方法及选择了适宜的测定印迹纳米粒与模板分子的相互作用的方法。在本课题第一部分基础上,第二部分主要探索构建一种具有肿瘤靶向性的印迹聚合物纳米载体。首先,采用蛋白“嫁接”策略,以p32序列为模拟对象,以蜂毒明肽为模板,将p32上N端的关键氨基酸“嫁接”到蜂毒明肽上,经圆二色谱表征,设计合成的多肽HAPPE具有典型的α螺旋结构。再以该多肽HAPPE为印迹模板分子,丙烯酰胺类为单体,采用反相微乳液聚合法开展分子印迹。印迹形成的纳米粒的平均粒径为40nm左右,大小适宜,分布均匀。体外结合实验显示印迹聚合物纳米粒与p32结合平衡常数Kd为11.9-40.1nM。选取N端具有α螺旋结构的磷脂酶A2、分子量与p32相近的小鼠神经生长因子为竞争蛋白,但印迹纳米粒与这两种竞争蛋白均无结合,结果提示印迹聚合物纳米粒具有与模板分子相同的“空穴”,并能与之进行特异性结合。流式细胞仪测定4T1和BxPC-3细胞对纳米粒的摄取结果显示MIPNPs组的荧光强度均是NIPNPs组的3倍左右；小动物活体成像测定体内分布结果表明,与NIPNPs相比,MIPNPs能靶向识别肿瘤。细胞和体内水平均表明印迹聚合物纳米粒对p32蛋白具有靶向性。对载体进行初步安全性评价,结果表明在一定的剂量范围内,印迹聚合物纳米粒对细胞及机体均没有明显毒副作用,这为载体的应用奠定了基础。综上所述,本课题提出了构象表位印迹策略并采用该策略构建了多肽功能分子“间接”介导肿瘤靶向的纳米载体,有效规避了传统的导向分子不稳定性的问题,提高了印迹聚合物与模板分子的结合效果；证实了印迹模板多肽空间结构对印迹聚合物印迹效果的重要性,表明选择靶蛋白的构象表位进行印迹所形成的印迹聚合物纳米粒对靶蛋白具有更强的特异性结合。本研究为以聚合物纳米粒为基础的靶向识别和治疗领域提供了新的研究思路。
【关键词】：构象表位 印迹 纳米载体 肿瘤靶向
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 绪论12-22
• 1 研究背景12-19
• 1.1 分子印迹技术12-16
• 1.2 导向分子介导肿瘤靶向纳米载体的进展16-19
• 2 课题设计和研究内容19-22
• 2.1 课题设计19-20
• 2.2 研究目的和内容20-21
• 2.3 课题创新点21-22
• 第一部分 构象表位印迹策略的可行性研究22-36
• 第一节 印迹聚合物纳米粒的制备与表征22-25
• 1.1 材料与仪器22
• 1.1.1 材料22
• 1.1.2 仪器22
• 1.2 实验方法22-24
• 1.2.1 蜂毒明肽与其线性衍生物的合成与表征22-23
• 1.2.2 反相微乳液聚合法制备印迹聚合物纳米粒23
• 1.2.3 纳米粒的表征23-24
• 1.3 结果与讨论24-25
• 1.3.1 apamin与linear apamin的圆二色谱学结构表征24
• 1.3.2 纳米粒的表征24-25
• 第二节 印迹聚合物纳米粒与模板肽相互作用的检测25-29
• 2.1 材料与仪器25-26
• 2.1.1 材料25-26
• 2.1.2 仪器26
• 2.2 实验方法26-27
• 2.2.1 异硫氰酸荧光素(FITC)标记多肽26
• 2.2.2 测定A-MIPNPs、L-MIPNPs和NIPNPs与模板apamin相互作用26-27
• 2.3 结果与讨论27-29
• 2.3.1 表面等离子共振法测定纳米粒与模板apamin的相互作用27
• 2.3.2 荧光偏振法测定纳米粒与模板apamin的相互作用27-29
• 第三节 印迹聚合物纳米粒的功能评价29-34
• 3.1 材料与仪器29
• 3.1.1 材料29
• 3.1.2 仪器29
• 3.2 实验方法29-30
• 3.2.1 蜂毒明肽与纳米粒先孵育后注射29
• 3.2.2 蜂毒明肽与纳米粒依次注射29
• 3.2.3 蜂毒明肽-胶束与纳米粒先孵育后注射29-30
• 3.2.4 蜂毒明肽-胶束与纳米粒依次交替注射30
• 3.2.5 共聚焦显微镜检测纳米粒中和蜂毒明肽-胶束30
• 3.3 结果与讨论30-34
• 3.3.1 纳米粒中和蜂毒明肽30-31
• 3.3.2 纳米粒中和蜂毒明肽-胶束31-34
• 小结34-36
• 第二部分 印迹聚合物纳米粒的设计、制备及功能评价36-52
• 第一节 印迹聚合物纳米粒的设计、制备与表征36-39
• 1.1 材料与仪器36
• 1.1.1 材料36
• 1.1.2 仪器36
• 1.2 实验方法36-38
• 1.2.1 多肽(HAPPE)的设计、合成及表征36-37
• 1.2.2 反相微乳液聚合法制备印迹聚合物纳米粒37
• 1.2.3 纳米粒的表征37-38
• 1.3 结果与讨论38-39
• 1.3.1 HAPPE的圆二色谱学结构表征38
• 1.3.2 纳米粒平均粒径和分布的测定38-39
• 1.3.3 纳米粒外观形态的考察39
• 第二节 印迹聚合物纳米粒与P32相互作用的检测39-42
• 2.1 材料与仪器39
• 2.1.1 材料39
• 2.1.2 仪器39
• 2.2 实验方法39-40
• 2.2.1 异硫氰酸荧光素(FITC)标记p32及竞争蛋白39
• 2.2.2 测定纳米粒MIPNPs和NIPNPs与p32的相互作用39-40
• 2.3 结果与讨论40-42
• 2.3.1 荧光偏振法测定MIPNPs和NIPNPs与p32的相互作用40-41
• 2.3.2 荧光偏振法测定竞争性结合41-42
• 2.3.3 选择性结合实验42
• 第三节 印迹聚合物纳米粒的功能评价与载体安全性评价42-50
• 3.1 材料与仪器42
• 3.1.1 材料42
• 3.1.2 仪器42
• 3.2 实验方法42-45
• 3.2.1 细胞对纳米粒的摄取42-43
• 3.2.2 小动物活体成像检测体内分布43-44
• 3.2.3 载体安全性考察44-45
• 3.3 结果与讨论45-50
• 3.3.1 体外靶向性45-46
• 3.3.2 体内靶向性46-48
• 3.3.3 载体安全性评价48-50
• 小结50-52
• 全文总结52-54
• 参考文献54-60
• 致谢60-62
• 在校期间科研成果62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Anti-tumor Activity of Biodegradable Polymer-paclitaxel Conjugated Micelle Against Mice U14 Cervical Cancers[J];Chemical Research in Chinese Universities;2012年04期

  本文关键词：基于构象表位印迹策略的肿瘤靶向纳米载体研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：450493