新型广谱β-内酰胺酶抑制剂的设计、合成和活性评价

发布时间：2017-06-30 08:15

  本文关键词：新型广谱β-内酰胺酶抑制剂的设计、合成和活性评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：β-内酰胺类抗生素是临床上最主要的抗菌药物,它能够作用于细菌细胞壁的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs),阻碍细胞壁的主要成分肽聚糖的合成,由于缺乏完整的细胞壁,在渗透压的作用下,细菌不能维持正常的形态,最终导致细胞破裂死亡,而达到杀菌的目的。但是,自从青霉素在临床上运用以来,迫于生存压力,细菌对抗生素产生了耐药性,其中最主要的耐药机制就是产生能够水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶(β-lactamase enzymes)。随着β-内酰胺类抗生素的种类增加,β-内酰胺酶的种类也在不断增多,并且在新的抗生素上市不久后就会出现能够水解该类抗生素的酶。根据Ambler分类法,β-内酰胺酶被分为A、B、C、D四类,其中,由于A、C、D类酶的活性位点都有活性丝氨酸残基,又将它们称为丝氨酸酶。而B类酶的活性位点含有一个或两个金属锌离子,故也称为金属β-内酰胺酶。目前,拥有多种耐药机制和能够表达多种β-内酰酶的多重耐药菌(multiple resistance bacteria,MDR)是临床上最具威胁性的致病菌。为了克服β-内酰胺酶的耐药性问题,人们将β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组成复方制剂使用,极大地提高了β-内酰胺类抗生素的抗菌活性。β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺酶作用时,首先形成Michaelis复合物,然后酶活性位点处的丝氨酸残基对β-内酰环上的羰基进行亲核进攻,使内酰胺环的酰胺键断裂,形成酶-底物共价化合物,使酶处于抑制状态。目前,市场上的β-内酰胺酶抑制剂主要有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦,它们都含有与β-内酰胺类抗生素相似的β-内酰胺环结构。但是,克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦只对A类丝氨酸酶有效,对B、C、D类酶基本没有抑制效果,面对种类不断增多的广谱酶和多重耐药菌,现有的β-内酰胺酶抑制剂根本无法满足临床的需求。阿维巴坦(Avibactam),属于二氮杂二环辛烷类化合物。2015年2月,美国FDA批准由阿特维斯(Actavis)与阿斯利康(AZN)联合研发的新型复方制剂抗生素药Avycaz(ceftazidime-avibactam,头孢他啶-阿维巴坦)在美国上市,主要用于治疗成人复杂性腹腔内感染(cIAI)及复杂性尿路感染(cUTI),同时也适用于治疗方案有限或无替代治疗方案的肾脏感染(肾盂肾炎)患者。与经典的“自杀式酶抑制剂”相比,阿维巴坦与酶的作用机制有其独特的优越性:在丝氨酸酶的亲核进攻下,阿维巴坦酰胺键断裂,开环形成酶-抑制剂共价化合物,使酶处于抑制状态,且不发生水解,再经环化恢复β-内酰胺环,重新得到具有抑酶活性的阿维巴坦。开环速率远远大于合环速率,使酶基本处于抑制状态。由于阿维巴坦的结构能恢复,故具有长效性。阿维巴坦的出现,打破了30多年来无新的β-内酰胺酶抑制剂可用的局面,由于阿维巴坦对a、c类酶和部分d类酶都具有抑制作用,对未来研发具有更广谱的β-内酰胺酶抑制剂开辟了新的道路,但是到目前为止仍然没有对b类金属β-内酰胺酶和大部分d类酶起作用的β-内酰胺酶抑制剂。本文以阿维巴坦作为先导化合物,基于初步建立的构效关系以及对酶-抑制剂晶体复合物的空间构象和作用机制分析,设计了两类具有二氮杂二环辛烷结构并且保持阳性化合物原有构型的β-内酰胺酶抑制剂,期望得到抑酶活性更好并且更具广谱性的新型β-内酰胺酶抑制剂。本文对文献报道的阿维巴坦合成工艺进行了改造和优化。以(s)-1-(苄氧羰基)-5-氧代吡咯烷-2-羧酸为起始原料,经过13步反应得到阿维巴坦的钠盐。将文献中的反应从15步缩短为13步;文献中所有反应产物采用硅胶柱层析法分离纯化,本文大部分采用重结晶方法替代;本文还对反应过程中的参数进行优化和确定,使反应具备可控性和可重复性。阿维巴坦的光学纯度和化学纯度经过hplc检测,而na+含量还经过agilenticp-ms测定,并且建立了有效的阿维巴坦化学纯度和光学纯度的检测方法。改进后的工艺具有合成路线相对较短、操作简单等优点,并且收率比原文献提高了两倍,为进一步研发适合工业生产阿维巴坦的工艺路线奠定了重要基础。参照阿维巴坦的合成工艺路线,本文合成了目标化合物的关键中间体(2s,5r)-6-(苄氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂环[3.2.1]辛烷-2-羧酸,在关键中间体的基础上设计合成了两类目标化合物,总共合成19个新结构目标化合物,所有合成的中间体和目标化合物结构都经过esi-ms和1h-nmr确认。目前,已经对包括阳性化合物阿维巴坦在内的20个化合物进行了初步的生物活性评价。首先对酶进行了滴定实验,然后将待检测目标化合物配成12个浓度梯度,分别与classa类tem-1、classc类ampc和classd类oxa-23酶发生作用。以头孢硝噻为底物,加入到酶与目标化合物的混合物中,通过检测混合物的吸光度,确定底物的含量,从而得出目标化合物对酶的抑制率,以目标化合物的ic50值来表示抑酶活性大小。通过生物活性评价结果显示,r2基为苄氧基取代的第Ⅰ类目标化合物ic50值普遍较高(10000nm);而保留先导化合物中的磺酸酯基,对r1进行改造得到的第Ⅱ类目标化合物ic50值较低,具有较好的抑酶活性,特别是r1基为饱和脂肪链烃取代的目标化合物。其中化合物l13、l14、l15和l19,同时对classa类酶tem-1和classc类酶ampc的ic50值都小于10nm,优于阳性化合物阿维巴坦,具有进一步研究的价值。根据活性筛选结果,本文对所合成的新目标化合物进行了初步的构效关系分析:当R1为4~5个C的饱和脂肪链烷烃,R2为磺酸酯基时,对A、C类酶的抑制活性较好;当R2为苄氧基时,活性较差。以上分析结果对进一步研发新型广谱β-内酰胺酶抑制具有一定指导意义。
【关键词】：β-内酰胺酶 β-内酰胺酶抑制剂 阿维巴坦 化学合成 生物活性评价
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91;R914.5
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 第一章 前言11-28
• 1.1 细菌耐药性12-18
• 1.2 β-内酰胺酶水解β-内酰类抗生素的作用机制18-21
• 1.3 β-内酰胺酶抑制剂21-23
• 1.4 具有临床运用前景的 β-内酰胺酶抑制剂23-28
• 第二章 目标化合物的设计28-31
• 2.1 阿维巴坦构效关系分析29
• 2.2 目标化合物的设计29-31
• 第三章 目标化合物的合成31-51
• 3.1 阿维巴坦的合成工艺研究31-34
• 3.2 目标化合物的合成34-39
• 3.3 实验部分39-51
• 第四章 生物活性评价及结果分析51-57
• 4.1 实验目的51
• 4.2 实验材料和仪器51
• 4.3 实验过程51-54
• 4.4 实验结果54-56
• 4.5 实验结论与构效关系分析56-57
• 第五章 结语57-58
• 参考文献58-64
• 附图64-99
• 个人简历99-100
• 致谢100-101

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本文编号：501202