唑类药物与氟西汀联合应用通过减弱毒力因子逆转白色念珠菌耐药性的作用与机制研究

发布时间：2017-07-01 01:15

  本文关键词：唑类药物与氟西汀联合应用通过减弱毒力因子逆转白色念珠菌耐药性的作用与机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：近年来,由于广谱抗生素、抗肿瘤药物的大范围应用,放射治疗和移植手术过程中的免疫抑制,免疫缺陷疾病患者尤其是艾滋病患者年增加等原因,白色念珠菌感染发生率不断提高。以氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑为代表的三唑类药物是临床应用最广泛的抗真菌药。近年来,白色念珠菌对唑类耐药菌株的发生率不断升高,因此临床上迫切需要新的有效的治疗方案。将效果逐年下降的抗真菌药物与已获得上市的非抗真菌药联合使用,可以在减少抗真菌药剂量的同时发挥增效、减毒的作用。选择性五羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)近年来被人们发现具有抗真菌活性,但目前针对SSRIs抗真菌活性的研究多集中在使用棋盘法简单测定MICs上,缺少动态活性以及相关的体内研究。而且,目前的研究都集中在对抗真菌作用的测定上,更进一步深入的机制研究仍属空白。若能透彻研究选择性五羟色胺再摄取抑制剂与唑类药物的协同抗菌机制,可以对抗真菌耐药现象产生重大的理论和现实应用意义。目的：本课题评价唑类药物与氟西汀联合对耐药的念珠菌的体外静态及动态抗真菌作用,建立大蜡螟感染模型评价体内抗真菌作用,并探索可能的协同作用机制。方法：选择白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等11株耐药念珠菌。参照CLSI M27-A3方法中的棋盘法测定最小抑菌浓度,以真菌生长与对照孔相比80%抑制为判断重点,用生长百分数差值模型(AE)和分数抑菌浓度指数法(FICI)评价药物联用的效果。对于联合作用的动态评价,在药物干预后的0,12,24,36和48h使用XTT法测定各孔的OD值。用药物作用时间为x-轴,OD值为y-轴绘制时间-杀菌曲线。最后,选择氟西汀和氟康唑作为实验药物,测定两药联合对耐药白色念珠菌的生物膜的作用,分别在0,4,8,12,24和48h测定生长率。之后,本课题使用大蜡螟建立白色念珠菌感染模型,分别以生存率、体内真菌清除率和组织病理切片三个方面评价药物联用对白色念珠菌的体内作用。药物联用协同抗真菌的机制研究包括：使用卵黄琼脂培养基体外测定氟康唑浓度固定的情况下,氟西汀对白色念珠菌的胞外磷脂酶活性的影响：使用实时定量PCR测定分泌型天冬氨酸蛋白酶编码基因SAP1, SAP2, SAP3, SAP4在不同药物干预后的相对表达量。结果：氟西汀与氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑联用对耐药白色念珠菌的FICI值0.5,ΔE加和200%,表现出强烈的协同作用。对耐药非白色念珠菌的FICI值在0.5-1.5之间,表现为无关作用。时间-杀菌曲线法进一步证实。在加入药物后不同的时间点,药物联用可明显抑制真菌生长,并持续较长的作用时间。这一结果与棋盘法实验结果相一致。微量稀释法发现,氟康唑和氟西汀联用在24小时内(4,8,12h)对白色念珠菌生物膜表现出协同抗真菌作用,但作用弱于对抗浮游菌。该协同作用随生物膜生长时间的延长逐渐减弱。体内实验部分发现,氟康唑与氟西汀联用时,大蜡螟的生存率高于对照组和氟康唑单用组的大蜡螟,结果具有统计学意义(p0.05)。当氟康唑与氟西汀联用后,24小时后大蜡螟体内的真菌数仅为注射量的1/5。随时间延长,药物联用组的真菌数虽有上升,仍显著低于对照组和FLC单用组。另外,病理组织切片的染色标本同样可以看到,感染后使用氟西汀与氟康唑联合干预,可以抑制白色念珠菌在大蜡螟体内形成菌丝,减轻组织破坏程度。对药物联用的协同作用机制研究中,分泌型天冬氨酸蛋白酶的编码基因SAP1-SAP4均在加入FLC与FLUO后表达量显著下降,其中,SAP4最为显著,表达量是FLC单用组的1/8。另外,虽然白色念珠菌的细胞外磷脂酶活性似乎不受到低浓度FLUO的影响,但当FLUO浓度上升至64μg/ml及以上时,磷脂酶活性急剧下降,几乎看不到抑菌圈。结论：唑类药物与选择性五羟色胺再摄取抑制剂氟西汀联用在体内和体外均对耐药白色念珠菌表现出协同作用,并对白色念珠菌生物膜同样有效。两药协同抗白色念珠菌的作用机制与减少分泌型天冬氨酸蛋白酶编码基因SAP1,SAP2,SAP3,SAP4的表达和抑制白色念珠菌胞外磷脂酶活性有关。本课题的研究发现为抗真菌药物的研发和临床应用提供了新的思路。
【关键词】：耐药白色念珠菌 药物联合 协同作用 选择性五羟色胺再摄取抑制剂 毒力因子
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 符号说明12-13
• 前言13-17
• 第一章 三唑类抗真菌药物与氟西汀对耐药念珠菌的体外联合作用17-29
• 1. 材料17-19
• 1.1 药品与主要试剂17-18
• 1.2 药品、培养基与其他主要试剂的配制18-19
• 1.3 实验菌株筛选19
• 1.4 主要仪器19
• 2. 试验方法19-23
• 2.1 三唑类与氟西汀联合抗念珠菌静态作用测定19-21
• 2.2 药物联合动态抗白色念珠菌活性测定21-22
• 2.3 药物联用抗白色念珠菌生物膜作用测定22-23
• 3. 试验结果23-28
• 3.1 三唑类药物与氟西汀联合抗念珠菌的静态作用23-26
• 3.2 时间-杀菌曲线法对体外动态联合抗白色念珠菌作用的测定结果26-27
• 3.3 氟康唑与氟西汀联用对耐药白色念珠菌生物膜的sMIC值27-28
• 4. 讨论28
• 5. 结论28-29
• 第二章 氟康唑与氟西汀对耐药白色念珠菌的体内联合作用29-42
• 1. 材料29-30
• 1.1 药品与主要试剂29
• 1.2 药品、培养基与其他主要试剂的配制29-30
• 1.3 实验菌株筛选30
• 1.4 主要仪器30
• 2. 试验方法30-35
• 2.1 建立白色念珠菌感染的大蜡螟幼虫模型30-31
• 2.2 氟康唑与氟西汀联用对白色念珠菌感染大蜡螟的生存率的影响31-32
• 2.3 白色念珠菌感染大蜡螟的真菌清除率实验32-33
• 2.4 白色念珠菌感染大蜡螟的组织病理学实验33-35
• 3. 试验结果35-40
• 3.1 建立白色念珠菌感染的大蜡螟幼虫模型35
• 3.2 氟西汀与氟康唑联用对大蜡螟生存率的影响35-37
• 3.3 氟西汀与氟康唑联用对大蜡螟体内真菌清除率的作用37-38
• 3.4 氟西汀与氟康唑联用对大蜡螟组织病理变化的影响38-40
• 4. 讨论40-41
• 5. 结论41-42
• 第三章 氟康唑与氟西汀联用对耐药白色念珠菌毒力因子的影响42-52
• 1. 材料42-44
• 1.1 药品与主要试剂42-43
• 1.2 药品、培养基与其他主要试剂的配制43
• 1.3 实验菌株筛选43
• 1.4 主要仪器43-44
• 2. 试验方法44-49
• 2.1 FLC与FLUO联用对SAP1-SAP4基因表达的影响44-48
• 2.2 胞外磷脂酶活性测定48-49
• 3. 试验结果49-50
• 3.1 分泌型天冬氨酸蛋白酶编码基因SAP1-SAP4的表达水平49-50
• 3.2 FLUO对白色念珠菌胞外磷脂酶活性的影响测定50
• 4. 讨论50-51
• 5. 结论51-52
• 全文小结52-54
• 参考文献54-58
• 致谢58-59
• 攻读硕士学位期间发表论文59-60
• 学位论文评阅及答辩情况表60

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本文编号：504146