HIV-1假病毒筛选药物体系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究

发布时间：2017-07-08 08:08

  本文关键词：HIV-1假病毒筛选药物体系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究

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【摘要】：[目的]建立并优化VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒筛选抗HIV-1药物体系,对初筛活性好的化合物进行体外抗HIV-1活性研究。[方法]采用Promega公司的荧光素酶活性分析系统,比较了VSVG/HIV-1NL4-3Luc对4种不同细胞的感染力。采用3种不同实验条件对不同类型HIV-1上市药物进行活性评价,进一步验证了该模型的可行性与有效性。随后,应用该系统对特定靶点化合物进行筛选,并与HIV-1ⅢB病毒筛选体系所得结果进行比较。最后,对该系统筛选的活性较好的样品采用MTT法检测了化合物对不同细胞株的毒性作用,用ELISA测p24的方法进行不同病毒株的药效评价。[结果]VSVG/HIV-1NL4-3 Luc对CRFK细胞的感染力最强,报告基因的表达水平与加入的病毒量呈剂量依赖关系。比较3种不同实验条件下不同阳性药物抑制VSVG/HIV-1NL4-3 Luc的EC50,发现方法3条件最优。而用该方法对化合物进行筛选,发现其EC50与病毒HIV-1ⅢB所得EC50基本一致。对几个抗病毒活性较高的化合物进行进一步的研究发现：DY1108、DY1118、DY1203和DY1204对C8166、MT-4、H9及PBMC细胞无明显细胞毒性,CC50均200μg/ml;DY1119、DY1208和DY1209具有广谱的抗HIV-1活性,对实验株(HIV-1ⅢB)、耐药株(NRTI耐药株HIV-174V、PI耐药株HIV-1RF/V82F/184V、FI耐药株HIV-1NL4-3 gp41 (36G) N42S)和临床株(HIV-1KM018、HIV-1TC-1、HIV-1Wan)的复制均具有很强的抑制作用,ECso均在纳克每毫升水平,而NNRTI耐药株(HIV-1A17)对这些化合物表现出不同程度的耐药；其余化合物对实验株、耐药株和临床株也表现出较好的抑制效果；DY1119、DY1208和DY1209对HIV-1重组逆转录酶有较好地抑制作用,IC50分别为0.496μg/ml、0.038μg/ml、0.060μg/ml,其余抑制作用较弱。[结论]本研究成功建立并优化了基于VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒的抗HIV药物筛选体系,该平台可进行NNRTI、NRTI和INI的筛选,不适用于PI和FI的筛选。此假病毒模型的建立节省了人力、物力和财力,我们在2级生物安全实验室即可进行大规模的药物筛选和抗HIV-I活性评价。对化合物的抗HIV-1活性研究表明,DY1119、DY1208IDY1209对不同病毒株有很强的体外抗HIV-1活性,我们希望能给致力于研发抗HIV-1药物的研究者提供抗病毒活性的参考,促进抗HIV-1药物的发展。
【关键词】：HIV-1假病毒 药物筛选 优化 应用 抗HIV-1活性
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96;R943
【目录】：

• 中英文缩略词表7-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-19
• 1 HIV-1病毒12-16
• 2 HIV-1假病毒16-18
• 3 本研究的思路、方法和意义18-19
• 材料与方法19-35
• 1 实验材料19-23
• 1.1 试剂19
• 1.2 溶液19-21
• 1.3 细胞21-22
• 1.4 病毒22
• 1.5 菌株22
• 1.6 质粒22-23
• 1.7 待测化合物和阳性对照药物23
• 1.8 主要仪器及设备23
• 2 实验方法23-35
• 2.1 假病毒筛选药物体系的条件优化及应用23-28
• 2.1.1 细胞的复苏与冻存23-24
• 2.1.2 DH5α超级感受态细胞制备24
• 2.1.3 质粒转化大肠杆菌感受态细胞24-25
• 2.1.4 质粒的制备25-26
• 2.1.5 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc的包装26
• 2.1.6 细胞系的选择26
• 2.1.7 荧光素酶活性分析26
• 2.1.8 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc感染性检测26-27
• 2.1.9 3种实验条件下阳性药物的检测27-28
• 2.1.10 化合物筛选28
• 2.2 抗HIV-1活性研究28-33
• 2.2.1 病毒滴度的测定28-29
• 2.2.2 HIV-1实验株和耐药株培养29
• 2.2.3 HIV-1临床分离病毒株培养29
• 2.2.4 PBMC的分离和培养29-30
• 2.2.5 捕捉p24抗原ELISA方法测定HIV-1的复制30
• 2.2.6 化合物对人淋巴细胞系的细胞毒性实验30-31
• 2.2.7 化合物对人PBMC细胞毒性实验31
• 2.2.8 化合物对实验株HIV-1_(ⅢB)急性感染C8166和MT-4细胞中病毒复制的抑制试验31
• 2.2.9 化合物对实验株HIV-1_(ⅢB)急性感染H9细胞中病毒复制的抑制试验31-32
• 2.2.10 化合物对耐药株急性感染C8166细胞中病毒复制的抑制试验32
• 2.2.11 化合物对临床分离株HIV-1_(KM018)、HIV-1_(TC-1)和HIV-1_(Wan)在PBMC中复制的抑制实验32-33
• 2.2.12 化合物对重组HIV-1逆转录酶活性的抑制实验33
• 2.3 计算公式33-35
• 结果35-55
• 1 假病毒筛选药物体系的条件优化35-39
• 1.1 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc可高效感染CRFK细胞35
• 1.2 CRFK中Luc表达水平与病毒接种量呈剂量依赖关系35-36
• 1.3 3 种不同实验条件下阳性药物对VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc的抑制作用36-37
• 1.4 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc筛选不同类型化合物37-39
• 2 抗HIV-1活性研究39-55
• 2.1 化合物对细胞的毒性作用39-44
• 2.2 化合物对实验株HIV-1_(ⅢB)的抑制作用44-48
• 2.2.1 化合物对HIV-1_(ⅢB)急性感染C8166细胞的抑制实验45-46
• 2.2.2 化合物对HIV-1_(ⅢB)急性感染MT-4细胞的抑制实验46-47
• 2.2.3 化合物对HIV-1_(ⅢB)急性感染H9细胞的抑制实验47-48
• 2.3 化合物对HIV-1耐药株的抑制作用48-51
• 2.4 化合物对HIV-1临床分离病毒株的抑制作用51-53
• 2.5 化合物对体外重组的HIV-1逆转录酶活性的抑制作用53-55
• 讨论55-58
• 结论58-59
• 参考文献59-64
• 综述64-78
• 参考文献73-78
• 攻读学位期间获得的学术成果78-79
• 致谢79-81
• 附录81-85

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本文编号：533662