P2X7受体阻滞剂对氧化应激所致红细胞损伤的保护机制

发布时间：2017-07-29 14:26

  本文关键词：P2X7受体阻滞剂对氧化应激所致红细胞损伤的保护机制

  更多相关文章： 红细胞 氧化应激 P2X7受体 Ca~(2+)

【摘要】：背景氧化应激在很多生理和病理现象中扮演重要的角色。红细胞--维持生命活动最重要的细胞之一,因为它对氧化应激高度的易损性,已经被用作为模型来研究生物膜的氧化损伤。P2X7受体(P2X7 receptor,P2X7R),是三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)敏感的嘌呤受体,可被细胞外ATP激活。P2X7受体的激活可导致非选择性阳离子的快速流通,最终引起细胞的肿胀破裂,即溶血。因此,研究P2X7受体在氧化应激所致红细胞损伤中的作用机制,为氧化应激所致红细胞损伤的保护性研究提供了新的思路和方法。目的1通过用不同浓度的对偶氮二异丁脒盐酸盐[2,2-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH]处理红细胞,观察AAPH对红细胞的影响。2通过用P2X7受体阻断剂亮蓝G(Brilliant Blue G,BBG)对AAPH所致的红细胞损伤进行保护,探讨氧化应激所致的红细胞损伤与P2X7受体之间的联系。3利用酶标仪检测技术、荧光显微镜检测技术、流式细胞仪检测技术检测红细胞损伤的评价指标[溶血率、渗透脆性、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻、细胞内Ca~(2+)浓度],探讨P2X7受体在氧化应激所致红细胞损伤中的作用机制。方法1取清洁级正常雄性Wistar大鼠的红细胞,用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)配成6.25%的红细胞悬液,用不同浓度的AAPH(10mmol/l、30mmol/l、50mmol/l、80mmol/l、100mmol/l)进行处理,在37℃的恒温水浴锅中孵育。分别在孵育后的不同时间点(30min、60min、90min、120min、150min、180min)取样,用酶标仪检测诱导样品的上清液中血红蛋白在540 nm处的吸光度值(OD值)。样品在去离子水中完全溶血时所释放的血红蛋白在540 nm处的吸光度值(OD值)作为基础值,计算样品在PBS溶液中的溶血率,公式为:溶血率(%)=(OD值_(PBS溶液)-OD值_(纯PBS溶液))/(OD值_(去离子水)-OD值_(纯去离子水溶液))×100%。2通过AAPH对红细胞损伤的时间依赖性和浓度依赖性曲线,选择一个合适的损伤浓度来引发红细胞的氧化损伤。同时用不同浓度的BBG(0.1 umol/l、0.3 umol/l、0.5 umol/l、1 umol/l、3 umol/l、5 umol/l、10 umol/l)进行干预保护。在37℃恒温水浴锅中孵育1.5 h后取样,用酶标仪检测诱导样品的上清液中血红蛋白在540nm处的吸光度(OD值)。样品在去离子水中完全溶血时所释放的血红蛋白在540nm的吸光度值(OD值)作为基础值,计算样品在PBS溶液中的溶血率,公式为:溶血率(%)=(OD值_(PBS溶液)-OD值_(纯PBS溶液))/(OD值_(去离子水)-OD值_(纯去离子水溶液))×100%。3通过前期的研究结果,选择一个合适的损伤浓度和保护浓度,从4个方面研究BBG对AAPH所致红细胞损伤的保护机制,即溶血率、渗透脆性、PS外翻、细胞内Ca~(2+)浓度变化。红细胞的溶血率利用样品中血红蛋白在540 nm处的吸光度值(OD值)来表示,即用酶标仪检测技术检测诱导样品上清液的血红蛋白的吸光度值,并以红细胞在去离子水中全部溶血时所释放的血红蛋白的吸光度值作为基础值,计算诱导样品红细胞在PBS溶液中的溶血率;利用红细胞在不同浓度NaCl缓冲盐溶液(0.3%、0.4%、0.9%,pH=7.4)的抵抗力的不同,检测红细胞的渗透脆性;用Annexin V-FITC标记PS外翻的红细胞,利用倒置荧光显微镜直观观察样品中红细胞PS外翻情况;用FLUO-3/AM标记红细胞内的Ca~(2+),利用荧光显微镜技术和流式细胞仪检测技术,来直观和定量的观察红细胞内Ca~(2+)浓度的变化。结果1与正常对照组(AAPH浓度为0 mmol/l)相比,AAPH组(10 mmol/l、30 mmol/l、50 mmol/l、80 mmol/l、100 mmol/l)发生不同程度的溶血现象(P0.05),而且在同一时间点,AAPH浓度越大,溶血现象越明显;同一浓度,随着时间的增大,溶血现象越明显。2当BBG保护浓度5umol/l时(0.1 umol/l、0.3 umol/l、0.5 umol/l、1 umol/l、3 umol/l),它对AAPH所致红细胞溶血并没有明显的保护作用;当BBG保护浓度为5 umol/l或10 umol/l时,它可使AAPH所引发的红细胞溶血现象明显减轻,溶血率明显下降(P0.05)。3与正常对照组相比,AAPH组:溶血率增加(t=4.242,P0.01),渗透脆性增加(t=16.88,P0.01),PS外翻的红细胞数量明显增多(t=10.307,P0.01),红细胞内Ca~(2+)浓度增加(t=9.407,P0.01)。用BBG进行干预保护后,与AAPH组相比,AAPH+BBG组:溶血率减少(t=3.582,P0.05),渗透脆性降低(t=4.766,P0.05),PS外翻的红细胞数量明显减少(t=3.504,P0.05),红细胞内Ca~(2+)浓度降低(t=4.076,P0.05)。结论1氧化应激可诱导红细胞的氧化损伤,这种损伤呈时间依赖性和浓度依赖性增加。2 P2X7受体参与氧化应激所致的红细胞损伤,且P2X7受体阻滞剂可有效抑制这种损伤。3 P2X7受体阻滞剂通过抑制P2X7受体激活,减少红细胞内Ca~(2+)内流,减少红细胞PS外翻的数量,降低红细胞渗透脆性,来抵抗氧化应激对红细胞造成的损伤。
【关键词】：红细胞 氧化应激 P2X7受体 Ca~(2+)
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-16
• 第一部分 AAPH对红细胞的影响16-20
• 材料与方法16-18
• 结果18-20
• 第二部分 BBG对AAPH所致红细胞氧化损伤的影响20-24
• 材料与方法20-23
• 结果23-24
• 第三部分 BBG对AAPH所致红细胞氧化损伤的保护机制24-35
• 材料和方法24-30
• 结果30-35
• 讨论35-38
• 小结38-39
• 参考文献39-45
• 综述：P2X7受体在红细胞损伤机制中的研究进展45-63
• 参考文献56-63
• 附录 1：附图63-64
• 附录 2：英文缩略词64-65
• 攻读学位期间发表文章情况65-66
• 致谢66-67
• 个人简历67

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本文编号：589612