球形芽胞杆菌X050晶体蛋白的特性及其抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-08-01 05:31

  本文关键词：球形芽胞杆菌X050晶体蛋白的特性及其抗肿瘤活性研究

  更多相关文章： 球形芽胞杆菌 发酵上清 晶体蛋白 抗肿瘤活性 凋亡

【摘要】：从长沙岳麓山采集的土样中筛选出一株芽胞杆菌,经抗肿瘤活性检测,结合形态特征观察、生理生化实验及16S rRNA基因Blast同源序列比对分析,确定了一株含伴胞晶体且高毒力球形芽胞杆菌新菌株,命名为Lysinibacillus sphaericus X050,简称BsX050(保藏号CCTCC NO:M 2014160)。测定BsX050菌株的发酵生长曲线,收集不同生长阶段的上清液,进行抗肿瘤实验,发现BsX050菌株进入稳定期后,发酵上清液对B16细胞和HeLa细胞具有明显的毒性。用60%的硫酸铵沉淀,粗提蛋白进行抗肿瘤谱的测定,结果表明BsX050菌株发酵上清液对B16、4T1、Hep-3B、HT29、MCF-7和HeLa具有广谱的抗肿瘤活性。进一步用GE-蛋白纯化仪(AKTA)和安捷伦超高效液相色谱(UHPLC)对发酵液中抗肿瘤活性物的分离纯化条件进行了初步优化。提取BsX050菌株的伴胞晶体进行电镜观察,结果发现伴胞晶体呈圆形或椭圆形,结构松散,致密性不好;SDS-PAGE检测及胶内酶解质谱鉴定,其为Surface protein SlpC OS,分子量为125kDa。Zn2+对伴孢晶体产量影响的分析表明Zn2+的浓度为10-6mol/L时伴胞晶体产量提高,Zn2+的浓度为10-3mol/L时伴胞晶体的产生基本被抑制。对伴胞晶体进行溶解性和稳定性分析,结果发现该伴胞晶体在pH为12.5,且不含β-巯基乙醇的50mM Na2CO3溶液中溶解出较多的晶体蛋白,胰蛋白酶与晶体蛋白的体积比为1/10,在37℃放置3h后,晶体蛋白全部被酶解成晶体毒素蛋白。晶体毒素蛋白作用4T1细胞,Hep-3B细胞和HUVEC细胞24h后,倒置显微镜和扫描电镜下观察到4T1和Hep-3B形态发生明显变化,而HUVEC的形态无明显变化,采用MTT法测定晶体毒素蛋白对4T1、Hep-3B和HUVEC的细胞毒力,发现晶体毒素蛋白对4T1和Hep-3B细胞毒力呈时间与浓度的依赖性,而对HUVEC细胞增殖无明显影响。激光共聚焦显微镜观察到晶体毒素蛋白能损伤4T1和Hep-3B的亚显微结构,细胞核皱缩变小,微管蛋白减少并向细胞核靠拢使细胞变圆,线粒体荧光强度减弱,而对HUVEC的亚显微结构无明显的损伤,晶体毒素蛋白处理4T1和Hep-3B细胞后,提取其DNA,凝胶电泳检测到DNA“梯状”条带,流式细胞术发现晶体毒素蛋白诱导4T1细胞发生凋亡,使细胞被阻滞在G0/G1期,western blotting发现Bax蛋白及PARP剪切蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。上述结果表明,晶体毒素蛋白对4T1和Hep-3B细胞毒性强,使其亚显微结构受损;晶体毒素蛋白诱导4T1细胞凋亡,使其被阻滞在G0/G1期,而对HUVEC细胞毒性不明显。这为球形芽胞杆菌毒蛋白的应用及其抗肿瘤机理的研究提供了菌株资源和奠定了理论基础。
【关键词】：球形芽胞杆菌 发酵上清 晶体蛋白 抗肿瘤活性 凋亡
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 引言13-24
• 1.1 芽胞杆菌简介13-14
• 1.2 球形芽胞杆菌的研究14-16
• 1.2.1 球形芽胞杆菌的基本特征14-15
• 1.2.2 球形芽胞杆菌的应用15-16
• 1.2.2.1 球形芽胞杆菌在蚊虫防治中的作用15-16
• 1.2.2.2 球形芽胞杆菌在环境中的作用16
• 1.2.2.3 球形芽胞杆菌在抗肿瘤中的作用16
• 1.3 抗肿瘤药物的研究进展16-23
• 1.3.1 恶性肿瘤概述16-17
• 1.3.2 抗肿瘤药物研究现状17-18
• 1.3.3 抗肿瘤药物获取途径18-20
• 1.3.4 芽胞杆菌抗肿瘤研究20-23
• 1.3.4.1 芽胞杆菌代谢产物抗肿瘤研究20-21
• 1.3.4.2 芽胞杆菌parasporins抗肿瘤研究21-23
• 1.4 立题依据和意义23-24
• 第二章 材料与方法24-41
• 2.1 材料24-31
• 2.1.1 质粒、菌株和细胞24
• 2.1.2 引物24-25
• 2.1.3 培养基和抗生素25
• 2.1.3.1 细菌培养基和抗生素25
• 2.1.3.2 细胞培养基和抗生素25
• 2.1.4 试剂25-29
• 2.1.4.1 主要试剂25-26
• 2.1.4.2 试剂盒26
• 2.1.4.3 酶和Marker26
• 2.1.4.4 琼脂糖凝胶电泳缓冲液试剂26
• 2.1.4.5 SDS-PAGE电泳试剂26-28
• 2.1.4.6 胶内酶解试剂28-29
• 2.1.5 反应体系29-30
• 2.1.5.1 PCR体系29
• 2.1.5.2 酶切体系29
• 2.1.5.3 连接体系29-30
• 2.1.6 主要仪器设备30-31
• 2.2 方法31-41
• 2.2.1 BsX050的分离纯化与鉴定31-33
• 2.2.1.1 BsX050分离纯化31-32
• 2.2.1.2 BsX050形态观察32
• 2.2.1.3 BsX05016S rRNA基因同源序列分析32-33
• 2.2.2 BsX050生长曲线测定33
• 2.2.3 BsX050生理生化实验33
• 2.2.4 BsX050发酵液抗肿瘤活性测定33-35
• 2.2.4.1 细胞培养33-34
• 2.2.4.2 BsX050不同生长阶段发酵上清液细胞毒性检测34
• 2.2.4.3 BsX050的代谢产物粗提物的抗肿瘤谱测定34-35
• 2.2.4.4 BsX050发酵上清中抗肿瘤活性物的分离35
• 2.2.5 BsX050伴胞晶体的特性35-37
• 2.2.5.1 BsX050伴胞晶体的提取35-36
• 2.2.5.2 电镜观察BsX050伴胞晶体36
• 2.2.5.3 SDS-PAGE分析BsX050晶体蛋白36
• 2.2.5.4 BsX050晶体蛋白的胶内酶解质谱鉴定36
• 2.2.5.5 BsX050晶体蛋白的溶解性和稳定性分析36-37
• 2.2.5.6 Zn~(2+)对晶体蛋白相对含量的影响37
• 2.2.5.7 测定BsX050菌株在含Zn~(2+)培养基中的生长曲线37
• 2.2.8 BsX050晶体毒素蛋白的抗肿瘤活性检测37-41
• 2.2.8.1 MTT实验测定细胞存活率38
• 2.2.8.2 扫描电镜观察细胞形态变化38
• 2.2.8.3 免疫荧光观察细胞亚显微结构的变化38-39
• 2.2.8.4 DNA Ladder检测细胞凋亡39
• 2.2.8.5 流式细胞术检测细胞的凋亡与坏死39
• 2.2.8.6 流式细胞术检测细胞周期阻滞39-40
• 2.2.8.7 Western blotting检测凋亡蛋白40-41
• 第三章 结果和分析41-63
• 3.1 BSX050鉴定41-45
• 3.1.1.形态特征41
• 3.1.2.系统发育树构建41-43
• 3.1.3.生理生化特征43-44
• 3.1.4 BsX050生长曲线44-45
• 3.2 BSX050发酵液抗肿瘤活性45-46
• 3.2.1 不同时期抗肿瘤活性45
• 3.2.2 BsX050代谢产物粗提物的抗肿瘤谱测定45-46
• 3.3.代谢活性物的初步分离纯化46-49
• 3.4.BSX050伴胞晶体特性研究49-54
• 3.4.1 BsX050伴胞晶体形态特性49
• 3.4.2 BsX050晶体蛋白SDS-PAGE检测及胶内酶解质谱鉴定49-50
• 3.4.3 BsX050晶体蛋白的溶解性和稳定性分析50-53
• 3.4.4 Zn~(2+)对BsX050菌株晶体蛋白产量的影响53
• 3.4.5 Zn~(2+)对BsX050菌株生长的影响53-54
• 3.5.BSX050晶体毒素蛋白抗肿瘤活性研究54-63
• 3.5.1 BsX050晶体毒素蛋白对细胞形态的影响54-56
• 3.5.2 BsX050晶体毒素蛋白对细胞活性和细胞增殖的影响56-57
• 3.5.3 BsX050晶体毒素蛋白对细胞亚显微结构的影响57-59
• 3.5.4 DNA Ladder59
• 3.5.5 BsX050晶体毒素蛋白诱导 4T1细胞发生凋亡59-60
• 3.5.6 western blotting检测细胞凋亡相关蛋白60-61
• 3.5.7 BsX050晶体毒素蛋白使 4T1细胞阻滞在G0/G1期61-63
• 第四章 讨论63-69
• 4.1 BSX050发酵液抗肿瘤活性63-64
• 4.2 芽胞杆菌代谢物分离及鉴定64-65
• 4.3 BSX050晶体蛋白65
• 4.4 BSX050晶体毒素蛋白抗肿瘤活性65-66
• 4.5 BSX050晶体蛋白诱导细胞凋亡66-67
• 4.6 BSX050晶体蛋白对细胞周期的影响67-69
• 第五章 小结69-70
• 参考文献70-78
• 缩略词表78-79
• 论文发表情况79-80
• 本论文感谢以下项目的资助80-81
• 致谢81

，

本文编号：602752