从天然药物中提取醛糖还原酶抑制剂及其活性研究

发布时间：2017-08-01 07:24

  本文关键词：从天然药物中提取醛糖还原酶抑制剂及其活性研究

  更多相关文章： 2型糖尿病 醛糖还原酶 天然药物 筛选 抑制剂

【摘要】：随着生活水平的提高、人口老龄化生活方式的改变,糖尿病发病率逐年增加。全世界有糖尿病患者3.82亿,我国的糖尿病患者已达1.14亿。糖尿病造成的死亡,已居当今世界死亡原因的第5位。目前全球每年约有320万人死于糖尿病诱发的并发症,在大部分发展中国家,已经成为多数国家人口死亡的主要死因之一。糖尿病及糖尿病并发症（diabetic complications, DCC）的治疗一直是医学研究的热点和难点。随着糖尿病患者病情的发展，患者易患糖尿病慢性并发症，约73.2%的糖尿病患者伴有一种或多种糖尿病并发症，而且晚期糖尿病并发症病人生存率非常低。研究发现多元醇代谢通路（polyol pathway，PP）的激活与糖尿病慢性并发症有关，醛糖还原酶（aldose reductase，AR）是体内糖代谢多元醇通路的关键酶，目前临床上醛糖还原酶抑制剂是预防、延缓和治疗糖尿病并发症的首选药物之一。但由于此类药物副作用大，限制了其临床使用，迫切需要开发新的更安全有效醛糖还原酶抑制剂。同时又由于醛糖还原酶价格昂贵，不利于建立一种高通量筛选醛糖还原酶抑制剂的模型。天然药物是指植物，动物，矿物等自然界中存在的有药理活性的天然产物。近年来国内外医药市场对天然药物需求的日益增大，呈现出快速增长的势头，对其进行研究已经成为当今非常热门的课题。天然药物的应用在中国有悠久的历史，与传统化学合成药物相比，天然药物更易获得，毒副作用小，成本更低，越来越受到人们的青睐，成为人们防病治病的优先选择。 本课题从天然药物中筛选醛糖还原酶抑制剂，并对其活性进行初步研究。通过检测醛糖还原酶关键辅酶NADPH的吸光度变化来衡量醛糖还原酶抑制程度，筛选出的对醛糖还原酶抑制效果突出的药物通过晶状体模型和肾小球系膜细胞模型再次筛选，晶状体和肾小球是糖尿病并发症影响较典型的部位，通过这两个部位的生理生化指标能够更好的反映天然药物对醛糖还原酶的抑制活性。本实验初步建立用于筛选具有抑制醛糖还原酶活性的天然化合物的药物模型，以多个角度从天然药物中筛选抑制糖尿病并发症的药物，为糖尿病及其并发症寻找新的治疗药物，特别是为体外筛选新的具有天然药物活性的醛糖还原酶抑制剂提供方法和依据。 本实验分为四部分： 1.从新鲜牛眼晶状体中提取醛糖还原酶，在磷酸盐缓冲液中手动研磨，梯度盐析，离心，透析，得到粗酶，，通过测定酶的活力和蛋白浓度测得酶的比活力为2.93U/mg，适合进行下一步实验。 2.选取80种天然药物，水提有效成分，从中筛选针对醛糖还原酶的抑制剂，根据IC50值筛选得到红景天，鸦胆子，青果，鹿衍草，僵蚕，麦冬等效果较好的药物，通过高糖晶状体模型和高糖肾小球系膜细胞（HBZY-1)模型，测得可溶性蛋白和各种抗氧化指标，综合地评价药物对醛糖还原酶导致的糖尿病并发症的治疗作用。 3.与药物共同培养的高糖晶状体通过石蜡切片直观地观察药物对于机体的积极作用。上述药物对于高糖损伤后的晶状体均有一定程度的恢复作用。 4.高糖和氧化损伤会导致晚期糖基化终产物（AGEs）的产生，AGEs会直接导致糖尿病的各种并发症，实验最后对抑制醛糖还原酶IC50值较低的药物红景天，鸦胆子，青果，鹿衍草进行讨论，上述药物均对晚期糖基化终产物的抑制效果较好，与醛糖还原酶抑制剂的结果相符。
【关键词】：2型糖尿病 醛糖还原酶 天然药物 筛选 抑制剂
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914;R96
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 前言10-21
• 1.1 2 型糖尿病10-18
• 1.1.1 2 型糖尿病及其并发症简介10-12
• 1.1.2 抗糖尿病药物的主要分类和作用靶点12-16
• 1.1.3 醛糖还原酶与糖尿病并发症的关系16-18
• 1.2 醛糖还原酶抑制剂治疗 2 型糖尿病18-20
• 1.2.1 醛糖还原酶抑制剂研究现状18-19
• 1.2.2 天然药物筛选醛糖还原酶抑制剂研究现状19-20
• 1.3 研究目的及意义20-21
• 第二章 实验材料与方法21-31
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 实验材料21
• 2.1.2 实验试剂及仪器21-22
• 2.1.3 主要实验溶液配制22-23
• 2.2 实验方法23-31
• 2.2.1 天然药物的提取方法23
• 2.2.2 牛眼晶状体中醛糖还原酶的提取方法23-24
• 2.2.3 考马斯亮蓝法测定醛糖还原酶蛋白质浓度24
• 2.2.4 醛糖还原酶活性测定24-25
• 2.2.5 醛糖还原酶抑制剂的抑制活性筛选与测定25-26
• 2.2.6 高糖诱导晶状体26
• 2.2.7 高糖培养后的晶状体石蜡切片，HE 染色26
• 2.2.8 测定高糖培养后的晶状体内可溶性蛋白含量26-27
• 2.2.9 测定高糖培养后的晶状体内 SOD 含量27-28
• 2.2.10 高糖培养 HBZY-1 细胞，MTT 毒性测定28-29
• 2.2.11 测定肾小球系膜细胞（HBZY-1）谷胱甘肽量29
• 2.2.12 测定肾小球系膜细胞 SOD 量29-30
• 2.2.13 体外测定晚期糖基化终产物（AGEs）30-31
• 第三章 结果与讨论31-41
• 3.1 牛眼晶状体提取醛糖还原酶31-41
• 3.1.1 牛眼晶状体中提取醛糖还原酶的蛋白浓度测定31-32
• 3.1.2 牛眼晶状体中提取醛糖还原酶酶活力32
• 3.1.3 酶的比活力32-33
• 3.1.4 天然药物的醛糖还原酶抑制活力33-34
• 3.1.5 高糖培养后的晶状体石蜡切片，HE 染色34-35
• 3.1.6 天然药物培养后的晶状体可溶性蛋白浓度变化测定35-36
• 3.1.7 高糖培养后的晶状体内 SOD 含量36-37
• 3.1.8 天然药物水提取物细胞毒性测定37-38
• 3.1.9 测定给药后 HBZY-1 细胞谷胱甘肽量(mg/L）38-39
• 3.1.10 测定给药后 HBZY-1 细胞 SOD 量(U/mL）39
• 3.1.11 体外测定晚期糖基化终产物（AGEs）含量：39-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 读研期间发表的文章47-48
• 致谢48

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本文编号：603086