表达HSA-IFNα2b的CHO细胞稳定株的构建及其无血清培养基优化

发布时间：2017-08-03 08:09

  本文关键词：表达HSA-IFNα2b的CHO细胞稳定株的构建及其无血清培养基优化

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【摘要】：干扰素α2b(Interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短从而限制其在临床上的应用。本研究室已成功构建人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)融合蛋白长效药物开发平台,将HSA与IFNα2b的N端(HSA-IFNα2b)融合并在毕赤酵母中成功表达。HSA-IFNα2b具有较好活性,但在毕赤酵母中表达融合蛋白时,存在融合蛋白不稳定、容易降解、产物不均一等问题。目前,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)表达系统表达的蛋白免疫原性低、人体相容性好、活性高。本课题将已经在毕赤酵母中表达HSA-IFNα2b的重组蛋白在高级表达系统CHO中进行表达制备,优化CHO发酵培养基并放大培养。本研究将IFNα2b连接到HSA的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建真核表达质粒pMH3/HSA-IFNa2b,电转转入CHO细胞中。经G418的抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/pMH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western Blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为31 mg/L。重组细胞株的稳定性试验结果显示,不同代数之间蛋白的表达量和生长情况没有明显的差异。最终,获得一株能悬浮培养、稳定表达的单克隆细胞株。为筛选获得最优的悬浮培养基,本研究选择十七种商业化无血清培养基,快速筛选得到生长和表达良好的基础培养基(BM)和流加培养基(F4)。进一步优化培养基,通过在培养基中添加功能性添加因子丁酸钠、亚油酸、乙醇胺、苏拉明。结果显示,在培养基中添加丁酸钠作为培养基的添加因子,获得高表达的个性化无血清培养基。重组细胞株在BM中培养,当细胞密度超过8×106 cells/m L,继续补加F4可以支持细胞批次培养超过10×106 cells/mL,同时在500 m L摇瓶中培养时间至10 d,融合蛋白表达量达到61.5 mg/L。通过添加的2 mM丁酸钠,融合蛋白表达增长至81 mg/L。进一步考察添加丁酸钠的过程中细胞的生长代谢情况,结果显示:丁酸钠添加后24 h细胞处于G1期比例由41%升高到62.9%,同时提高融合蛋白HSA-IFNα2b mRNA的表达高达2.6倍,并对细胞生长代谢无明显影响。最后,在3 L摇瓶中进行了流加培养,并在5 L的AP-20一次性生物反应器上进行通气与搅拌方面工艺的初步摸索,在反应器上得到与摇瓶中相对一致的培养效果,融合蛋白表达量达到137 mg/L,实现了从摇瓶到反应器的工艺放大。离心获得发酵上清液后,依次通过蓝色亲和染料层析、疏水层析对表达产物进行分离纯化,获得的融合蛋白HSA-IFNα2b纯度96.8%,目的蛋白的总回收率为22.3%。对纯化后融合蛋白的活性进行检测,比活性为4.16×106 IU/mg,与毕赤酵母表达融合蛋白HSA-IFNα2b的生物活性水平基本相当。
【关键词】：人血清白蛋白 干扰素α2b 中国仓鼠卵巢细胞 无血清培养基 丁酸钠
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 绪论9-19
• 1.1 长效干扰素的研究9-11
• 1.1.1 干扰素简介9
• 1.1.2 长效干扰素的研究9-11
• 1.2 中国仓鼠卵巢细胞表达系统的概述11-13
• 1.2.1 不同表达系统的研究11-12
• 1.2.2 中国仓鼠卵巢细胞表达系统的优点12
• 1.2.3 高效稳定的CHO表达系统策略的建立12-13
• 1.3 无血清培养基的研究13-16
• 1.3.1 无血清培养基的发展过程13
• 1.3.2 无血清培养基中的添加因子13-14
• 1.3.3 无血清培养基的优化以及个性化14-15
• 1.3.4 无血清培养基的悬浮适应15-16
• 1.4 细胞培养工艺的研究16-17
• 1.4.1 细胞培养的模式16-17
• 1.4.2 动物细胞大规模培养过程参数17
• 1.5 立题意义和研究内容17-19
• 第二章 实验材料和方法19-29
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 菌株、细胞株、质粒及引物19
• 2.1.2 实验试剂19-20
• 2.1.3 仪器设备20-21
• 2.1.4 培养基及溶液配制21
• 2.2 实验方法21-29
• 2.2.1 CHO细胞的培养与保种21-22
• 2.2.2 CHO重组细胞的构建22-23
• 2.2.3 重组细胞的构建与筛选23-24
• 2.2.4 细胞的悬浮驯化24
• 2.2.5 细胞批次培养实验24-25
• 2.2.6 细胞稳定性验证25
• 2.2.7 蛋白检测方法25-26
• 2.2.8 基础培养基批次筛选26
• 2.2.9 流加培养基筛选实验26
• 2.2.10 特殊因子的添加以及丁酸钠的流加培养26
• 2.2.11 细胞周期测定26
• 2.2.12 RNA提取和荧光定量PCR26-27
• 2.2.13 细胞培养过程中生化指标测定27
• 2.2.14 摇瓶的 3 L流加培养27
• 2.2.15 使用AP-20 一次性生物反应器 5 L流加培养27
• 2.2.16 融合蛋白的纯化27-28
• 2.2.17 纯化样品纯度检测28
• 2.2.18 纯化样品的生物活性检测28-29
• 第三章 结果与讨论29-46
• 3.1 融合蛋白表达质粒构建29
• 3.2 重组CHO细胞的构建与筛选29-32
• 3.2.1 CHO细胞株的构建及高克隆筛选29-31
• 3.2.2 重组CHO细胞悬浮驯化和批次实验31
• 3.2.3 重组细胞稳定性实验31-32
• 3.3 无血清培养基的筛选优化32-39
• 3.3.1 基础培养基的初筛和混合测试32-34
• 3.3.2 流加培养基筛选34-35
• 3.3.3 特殊因子的添加对细胞影响35-36
• 3.3.4 丁酸钠的添加对细胞影响36-39
• 3.4 摇瓶的 3 L流加培养和 5 L一次性生物反应器的流加培养39-41
• 3.4.1 摇瓶的 3 L流加培养39-40
• 3.4.2 AP-20 一次性 5 L激流生物反应器流加培养40-41
• 3.5 HSA-IFNα2b的分离纯化41-43
• 3.5.1 Blue Sepharose FF亲和层析41-42
• 3.5.2 Phenyl Sepharose FF疏水层析42-43
• 3.6 HSA-IFNα2b的检测43-46
• 3.6.1 纯化样品纯度检测43-44
• 3.6.2 纯化后样品Western Blot验证44
• 3.6.3 纯化样品生物活性检测44-45
• 3.6.4 纯化样品分子量检测45-46
• 第四章 主要结论与展望46-47
• 4.1 主要结论46
• 4.2 下一步研究工作展望46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-52
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文52

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本文编号：613321