口服雷帕霉素酵母微囊递送系统在靶向治疗动脉粥样硬化中的研究

发布时间：2017-08-06 09:18

  本文关键词：口服雷帕霉素酵母微囊递送系统在靶向治疗动脉粥样硬化中的研究

  更多相关文章： 动脉粥样硬化 口服靶向 酵母微囊 仿生 药物递送

【摘要】：动脉粥样硬化(AS)与多种心脑血管疾病如心肌梗死、脑梗死、肾缺血、间歇性跛行等有密切且直接的关系。近期研究表明,通过抑制平滑肌细胞增殖和迁移、选择性清除巨噬细胞以及其抗炎等多种作用,免疫抑制药物雷帕霉素(Rapamycin,RAP)及其衍生物能够减小AS斑块面积、改善斑块组成、并显著提高斑块稳定性,进而有效抑制AS发展。然而,目前的RAP制剂多为系统性给药,其血浆半衰期短,迅速从靶部位消除,导致AS斑块部位药物难以维持最低有效治疗浓度;药物均匀分布于各组织器官,无特异性导致全身毒副作用;故治疗效果十分有限,即使提高给药剂量也很难达到理想疗效。因此,开发有效性高、毒副作用低、患者依从性好的具有靶向性能的口服RAP药物递送系统,对治疗AS具有重要意义。本课题组前期研究发现,通过仿生途径,利用去除内容物的酵母微囊可以通过口服途径靶向至肿瘤部位及急性炎症部位。因此,在本课题中,通过类似的原理,模仿病菌通过肠道侵染机体的途径,利用酵母微囊作为载体,构建了用于治疗AS的口服RAP靶向递送系统。方法1.空白酵母微囊的制备称取一定量的啤酒酵母,经酸、碱、有机溶剂等处理后除去内容物,干燥后即得空白酵母微囊(YC)。2.酵母微囊对不同粒径的纳米粒的负载性能评价称取一定量的YC用p H 9.2碳酸盐缓冲液制备成混悬液,于37℃孵育30 min后,加入枝化聚乙烯亚胺(PEI),其中YC/PEI质量比为2:1,孵育过夜,离心水洗多次后,重悬液加入不同粒径的羧基修饰的聚苯乙烯纳米粒,37℃孵育8 h,离心水洗后,用激光共聚焦显微镜(CLSM)及透射电子显微镜(TEM)对酵母微囊负载纳米粒情况进行表征。3.雷帕霉素纳米粒的制备及表征称取一定量的pei?含羧基小分子药物及疏水性药物雷帕霉素(rap)共溶于二甲基亚砜(dmso)中,置于透析袋中,在纯水中透析24h后即得rap纳米粒(rapnp)?测定其粒径大小及表面电位,利用tem对纳米粒的形貌进行表征。4.雷帕霉素酵母微囊的制备及表征称取一定量的yc用水制备成混悬液,于40℃混悬孵育30min后加入rapnp混悬液,25℃混悬孵育过夜后,离心水洗后,冻干即得雷帕霉素酵母微囊(yc/rap)。测定其表面电位,用高效液相色谱法(hplc)测定载药量,tem及clsm对纳米粒在酵母微囊内部的包埋情况进行观察。5.雷帕霉素酵母微囊的体外释放评价配制ph1.2及ph7.4的磷酸盐缓冲液分别模拟胃肠道酸碱环境,将载药酵母微囊置于此模拟环境及rpmi1640培养基中,于特定时间离心取上清液。用hplc测定rap的释放量。6.巨噬细胞对yc的吞噬性能评价将5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(dtaf)标记的yc(yc/dtaf)与raw264.7细胞共孵育不同时间,清洗掉未吞噬的yc/dtaf后,溶酶体及细胞核染色,利用clsm和流式细胞仪对yc被巨噬细胞吞噬的情况进行评价。7.巨噬细胞对yc/rap的吞噬及药物胞内保留特性评价将巨噬细胞种植于孔板,加入yc/rap孵育不同时间后,pbs清洗,用细胞裂解液裂解细胞,离心取上清,测定总蛋白含量,用hplc测定溶液中rap浓度。8.口服酵母微囊对动脉粥样硬化斑块的靶向作用研究首先通过化学反应将近红外荧光花青染料7.5(cy7.5)化学键合到pei上面,用纯水透析后制备得到cy7.5纳米粒(cy7.5nps),然后将yc混悬液与cy7.5nps孵育得到荧光标记的酵母微囊(yc/cy7.5)。载脂蛋白e缺陷(apoe-/-)小鼠给予高脂饮食建立动脉粥样硬化模型,分别口服灌胃给予cy7.5nps或yc/cy7.5连续4天后,于第5天解剖取主动脉及各脏器组织,剥离脂肪后用活体成像观察并统计荧光强度。9.口服酵母微囊靶向动脉粥样硬化斑块的转运机制的初步研究基于apoe-/-小鼠建立as模型,口服灌注yc/dtaf连续两天后,于第3天解剖取主动脉及脾脏,分离巨噬细胞,免疫荧光染色后,用clsm观察。10.口服载药酵母微囊治疗动脉粥样硬化的药效学评价以apoe-/-小鼠建立as模型,口服给予生理盐水、yc、rap、rapnp及yc/rap,每三天一次,给药2个月后,取主动脉用油红o染色评价斑块生长情况;主动脉根部切片进行免疫组化染色后评价斑块、胶原等分布情况;取全血用流式细胞术测定单核巨噬细胞比例。11.口服载药酵母微囊治疗动脉粥样硬化的初步安全性研究取全血测定血常规;取血清测定血脂水平、肾功能、肝功能等;取血清测定炎性因子及活性氧水平;取主动脉研磨后测定组织炎性因子及活性氧含量;取各脏器称重计算脏器指数;取各脏器及胃肠道进行切片并做he染色观察脏器组织病理形态。结果1.基于静电相互作用,pei预处理的yc能够负载不同粒径大小的负电荷纳米粒,其最大粒径为750nm。2.基于同样的静电作用介导的自沉积过程,通过简单的混悬过程,yc能够成功负载正电荷的纳米粒,clsm及tem观察显示,纳米粒分散于酵母微囊的内部。hplc测定表明yc/rap载药量为1.0-4.5%,载药量与混悬孵育的时间及温度相关。3.yc/rap在ph1.2酸性介质中药物释放缓慢,而在ph7.4的环境下药物释放较为迅速。4.酵母微囊能够被巨噬细胞迅速吞噬,并且呈时间依赖性。同样,载药酵母微囊可被巨噬细胞吞噬,其药物rap在胞内保留时间较长。5.活体成像结果显示,yc/cy7.5经口服后能够显著提高cy7.5在动脉粥样硬化斑块部位的富集,分析各脏器组织荧光强度可以发现,在淋巴相关的肠系膜淋巴结、胸腺及小肠部位的荧光强度亦有显著增加。6.分离小鼠的脾脏及主动脉组织的巨噬细胞,发现酵母微囊主要分布于巨噬细胞内部。7.油红o染色显示,口服yc/rap后能够使apoe-/-小鼠的as斑块的比例显著降低,血清中相关促炎因子及活性氧水平显著降低。8.初步安全性评价表明血液生理指标、肝肾功能均无显著差异,脏器组织及胃肠道切片无明显病理变化。结论1.基于静电作用,yc能够负载的纳米粒的最大粒径为~750nm。通过自组装制备的带有正电荷的rap纳米粒,可以成功负载于yc内部。2.巨噬细胞能够有效吞噬载rap酵母微囊。3.口服给药后,yc能够靶向至小鼠动脉粥样硬化斑块部位,此过程与淋巴系统及组织关系密切。单核巨噬细胞在靶向过程中可能发挥重要的作用。4.口服YC/RAP能够有效降低AS斑块的生长,且副作用较低。综上所述,本课题模拟病菌通过肠道途径侵染机体的过程,以酵母微囊作为药物载体,构建了用于治疗AS的口服靶向性RAP递送系统,有望开发成为一种新型AS治疗药物。
【关键词】：动脉粥样硬化 口服靶向 酵母微囊 仿生 药物递送
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 雷帕霉素酵母微囊的制备及其理化性能表征18-32
• 2.1 雷帕霉素酵母微囊的制备及其表征18-28
• 2.1.1 材料与方法18-22
• 2.1.2 结果22-27
• 2.1.3 讨论27-28
• 2.2 雷帕霉素酵母微囊的体外释放行为评价28-31
• 2.2.1 材料与方法28-30
• 2.2.2 结果30-31
• 2.2.3 讨论31
• 2.3 本章小结31-32
• 第三章 口服酵母微囊靶向动脉粥样硬化的特性及机制研究32-52
• 3.1 巨噬细胞对酵母微囊的胞内摄取及其机制研究32-38
• 3.1.1 材料与方法32-35
• 3.1.2 结果35-37
• 3.1.3 讨论37-38
• 3.2 口服酵母微囊对动脉粥样硬化斑块的靶向特性评价38-44
• 3.2.1 材料与方法38-40
• 3.2.2 结果40-44
• 3.2.3 讨论44
• 3.3 酵母微囊靶向动脉粥样硬化斑块的机制研究44-51
• 3.3.1 材料与方法44-48
• 3.3.2 结果48-50
• 3.3.3 讨论50-51
• 3.4 本章小结51-52
• 第四章 口服雷帕霉素酵母微囊治疗动脉粥样硬化的药效学及安全性评价52-69
• 4.1 口服雷帕霉素酵母微囊治疗动脉粥样硬化的药效学评价52-63
• 4.1.1 材料与方法52-56
• 4.1.2 结果56-62
• 4.1.3 讨论62-63
• 4.2 口服雷帕霉素酵母微囊的初步安全性评价63-68
• 4.2.1 材料与方法63-65
• 4.2.2 结果65-68
• 4.2.3 讨论68
• 4.3 全章小结68-69
• 全文结论69-71
• 参考文献71-76
• 文献综述 仿生化药物载体在生物医药中的应用76-92
• 参考文献85-92
• 攻读学位期间的研究成果92-93
• 致谢93-95

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈秉初，，申屠文月，方芳，苏维埃;苜蓿悬浮细胞质膜微囊的制备[J];浙江师大学报(自然科学版);1994年01期

2 ;微囊织物初探[J];福建轻纺;2003年02期

3 杨彦彪;史彦斌;管玉珠;魏春华;杨会霞;;茶碱微囊制备工艺及体外释放度考察[J];卫生职业教育;2006年16期

4 蒋丽娟,史小丽,杨柳燕,肖琳,王凤平,高光,秦伯强;游离附生假单胞菌对铜绿微囊蓝细菌中~(32)P释放的影响[J];环境科学学报;2003年04期

5 王广金,褚良银,陈文梅,杨平,周明宇;微生物固定化聚醚砜微囊载体的制备及其性能研究[J];四川大学学报(工程科学版);2005年03期

6 辛茜;姜艳军;高静;周丽亚;马丽;贺莹;贾霏;;仿生制备有机-无机复合微囊固定化葡萄糖氧化酶(英文)[J];催化学报;2013年08期

7 赵国俊,姜涌明,姜守磊,吉鑫松,袁中一;壳聚糖的脱乙酰度、分子量和浓度对微囊制备和特性的影响（英文）[J];应用基础与工程科学学报;1999年02期

8 张磊,杨松,葛志强,储结根,元英进;重组α-2b干扰素缓释微囊制备工艺及体外释药过程研究[J];高校化学工程学报;2004年05期

9 廖志平;;维生素C微囊缓释片的制备[J];国际医药卫生导报;2006年12期

10 容建华;段泰炜;温鸿戈;屈小中;;热磁双重响应性载药微囊的制备及其性能研究[J];高分子学报;2010年04期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 史静;任楠;张亚红;唐颐;;沸石空心微囊合成及其机理研究[A];第十五届全国分子筛学术大会论文集[C];2009年

2 陈卫娅;汪卫星;向素琼;郭启高;何桥;李晓林;梁国鲁;;用于转染色体技术研究的枇杷微囊诱导与分离纯化[A];第六届全国枇杷学术研讨会论文（摘要）集[C];2013年

3 欧阳静萍;;质膜微囊(Caveolae)与疾病[A];湖北省暨武汉市病理生理学会第十二届学术年会论文汇编[C];2004年

4 徐鹏;陈懿玺;曹小勇;张蕤;;磁性中空PLA微囊的制备研究[A];中国化学会第29届学术年会摘要集——第33分会：纳米材料合成与组装[C];2014年

5 马小军;郑建华;王为;谢威扬;;克拉霉素漂浮-生物粘附微囊的制备及缓释性能的研究[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年

6 赵健;刘昌胜;;血红蛋白纳米微囊的制备与表征[A];2004年全国高分子材料科学与工程研讨会论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 杨晓红;农药微囊剂型为何难推广[N];农资导报;2010年

2 刘道安;天津微囊生物细胞移植研究获佳绩[N];中国医药报;2004年

3 施威;微囊织物初探[N];中国纺织报;2002年

4 记者　白毅;中科院过程所制备出尺寸均一的微球和微囊[N];中国医药报;2006年

5 张中桥;纳米微囊载体具有基因治疗潜能[N];保健时报;2005年

6 张骁;束梅英;纳米微囊在医药领域中的应用[N];中国医药报;2004年

7 褚良银;微囊膜：交叉学科发展新热点[N];中国化工报;2002年

8 张中桥;纳米微囊载体用于基因治疗[N];健康报;2005年

9 张中桥;纳米微囊载体具有基因治疗应用潜能[N];中国医药报;2004年

10 刘玉莉;LJ公司微囊纺织品令人关注[N];中国纺织报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前6条

1 张光远;人脐带间质干细胞分泌的微囊减轻大鼠缺血再灌注引发的急、慢性肾损伤的机制研究[D];上海交通大学;2015年

2 邓辅财;芘降解菌层层自组装微囊固定化及其促降解的作用机制[D];华南理工大学;2016年

3 杨希;微囊型淋巴管畸形的治疗及术后复发机制研究[D];上海交通大学;2014年

4 陆蓉;多功能聚乳酸微囊的制备与性能研究[D];上海交通大学;2010年

5 袁泰昌;脂质筏和质膜微囊在GLUT4转位调节中的作用[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2007年

6 张羽飞;仿生固定化酶制备及其催化特性研究[D];天津大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 卫小娟;人脐静脉内皮细胞内化骨髓间充质干细胞源膜微囊的途径探索[D];第四军医大学;2015年

2 张文燕;聚多巴胺—氧化钛杂化微囊的仿生制备与固定化酶研究[D];天津大学;2014年

3 张杏莉;“精油+有机酸”微囊包被制剂在肉鸡生产中的应用研究[D];福建农林大学;2016年

4 王鹏;基于门控效应的阿霉素印记微囊缓释递药系统构建与评价[D];南京医科大学;2013年

5 唐其省;细胞表面新型微囊泡的分离及其特性研究[D];南昌大学;2016年

6 张相军;口服雷帕霉素酵母微囊递送系统在靶向治疗动脉粥样硬化中的研究[D];第三军医大学;2016年

7 蒋泽权;声/磁双响应的自组装复合微囊及其性能研究[D];上海交通大学;2013年

8 俞婧;单核细胞源性微囊泡产生机制及其对肾小球系膜细胞的影响[D];天津医科大学;2014年

9 张元洪;细胞膜仿生微囊作为药物载体的基础研究[D];浙江大学;2014年

10 胡龙驹;骨碎补/聚乳酸—羟基乙酸共聚物微囊的实验研究[D];扬州大学;2013年

本文编号：629258