外源性磷酸肌酸对动脉粥样硬化斑块形成和稳定性的作用的研究
本文关键词：外源性磷酸肌酸对动脉粥样硬化斑块形成和稳定性的作用的研究
【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是许多心脑血管疾病的病理学基础,与氧化应激和炎性反应密切相关。磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)是一种高能磷酸化合物,在体内可为ATP循环提供磷酸基团,参与能量运输,是机体内最直接、最主要的供能物质之一目前PCr在临床上主要用于心脏手术时加入心脏停搏液中,以保护心肌缺血状态下的心肌代谢异常。许多研究表明,PCr除了在心肌保护中具有显著作用外,还因其具有的抗氧化作用和膜稳定作用等可以辅助治疗多种心血管疾病,如心力衰竭,心肌梗死,脑缺血等。在体外药理实验中表明PCr可以通过阻滞细胞周期从而抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。发表于2012年美国一项专利给药理研究释放了一个有意思的信号,它指出磷酸肌酸可以在体外溶解斑块,那么磷酸肌酸是否有预防和治疗动脉粥样硬化的作用,其可能的作用机制又是什么。本研究首次通过体内体外模拟AS疾病,发现磷酸肌酸可以有效抑制动脉粥样硬化斑块的形成,并且使粥样斑块趋于稳定,为患有心脑血管疾病合并动脉粥样硬化的患者用药提供了新的选择。目的1、观察外源性PCr对动脉粥样硬化斑块的形成和稳定性的作用。2、初步探讨外源性PCr对动脉粥样硬化疾病治疗作用的机理,及其对内皮细胞功能的作用。方法1、动物模型建立与分组7-8周雄性ApoE-/-小鼠,全程高脂饲料喂养(含0.25%胆固醇和15%脂肪)12周,于高脂四周后,颈动脉分离并套管,缝合后继续喂养八周,建立动脉粥样硬化早、晚期模型。高脂喂养八周之后,将小鼠随机分为五组：①阴性对照组(0.9%NaCl,0.1 ml/10g/d);②低剂量磷酸肌酸组(150mg/kg/d);③中剂量磷酸肌酸组(300mg/kg/d);④高剂量磷酸肌酸组(600mg/kg/d)⑤阳性对照组(辛伐他汀50mg/kg/d)。其中生理盐水与磷酸肌酸均为尾静脉注射给药,辛伐他汀混于食物中喂食。2、体重、血清指标检测小鼠处死前称量体重并取血,测定血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白四项指标。3、组织病理学检测与免疫组化染色取小鼠主动脉进行大体油红0染色,用Image-Pro Plus 6.0定量阳性染色面积百分比得到主动脉斑块大小；主动脉根及颈动脉进行冰冻组织切片,进行HE染色,观察斑块大小；切片进行油红O染色,MOMA-2抗体染色,α-SMA抗体染色,天狼猩红染色,观察主动脉根斑块中脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞以及胶原的含量,肌酸斑块的易损指数。主动脉根部切片进行DHE染色,观察斑块的活性氧含量。4、分子生物学检测取小鼠主动脉,western blot法测定MMP-2、MMP-9蛋白表达水平；使用BD公司CBA试剂盒和流式细胞测定仪检测IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1蛋白表达含量；qRT-PCR检测IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1、TIMP-1、MMP-2和MMP-9的mRNA水平含量；明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶pro-MMP-2,MMP-2,pro-MMP-9和 MMP-9 的活性5、探究PCr对内皮细胞的作用及机制CCK-8检测方法确定给药浓度为20mmM。以氧化性低密度脂蛋白(oxLDL,100μg/ml)为刺激物体外模拟动脉粥样硬化模型,Western blot法测定给予药物刺激之后正常组、正常加药组、oxLDL处理组、oxLDL处理加药组NOX2的蛋白表达；qRT-PCR法测定四组细胞炎性因子的mRNA水平；DCFH-DA与DHE染色分别标定内皮细胞中过氧化氢与超氧阴离子,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测活性氧的含量；检测PCr对MAPK不同家族激酶的作用。结果1、与NS组相比PCr各剂量组可以显著降低ApoE-/-小鼠的血清中甘油三酯水平；中剂量组和高剂量组可以降低低密度脂蛋白水平；中剂量组可以降低总胆固醇水平；各组小鼠血清中高密度脂蛋白水平无明显差异。2、与NS组相比,PCr各剂量组均可以降低ApoE-/-小鼠主动脉总体斑块面积,主动脉弓斑块面积和主动脉根斑块面积,降低斑块中ROS的含量,提高斑块的稳定性。3、蛋白检测中,与NS组相比,磷酸肌酸中剂量和高剂量降低了ApoE-/-小鼠MMP-9蛋白含量(P0.05)；各剂量对MMP-2蛋白的含量无显著影响；中、高剂量可显著降低IL-6和TNF-α蛋白水平(P0.05)；高剂量可降低MCP-1蛋白水平(P0.05)；各用药组对IL-10蛋白水平作用不明显。mRNA水平检测中,与NS组相比,磷酸肌酸中、高剂量可显著降低IL-6与TNFα的mRNA水平,升高IL-10和TIMP-1的mRNA水平；高剂量可显著降低MCP-1的mRNA水平(P0.05)。明胶酶谱法检测MMPs舌性可以看到,与NS组相比,磷酸肌酸各剂量组pro-MMP-2和MMP-2活性变化不明显,但各剂量均可显著降低pro-MMP-9和MMP-9的活性。4、PCr可以减少oxLDL刺激的内皮细胞中ROS的产生,降低NOX2的表达,减少促炎因子的分泌,并且通过抑制JNK的磷酸化水平减低MAPK信号通路的活化从而减少氧化应激和炎性反应,减轻内皮细胞的损伤。结论静脉注射磷酸肌酸钠对ApoE-/-小鼠具有明显的抗动脉粥样硬化作用,可以减小斑块面积,增加斑块稳定性,其机制可能与其调节血脂、抗炎抗氧化等作用有关,为临床上心脑血管疾病用药提供新的选择。
【关键词】：动脉粥样硬化 磷酸肌酸 炎症反应 氧化应激
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：
- 中文摘要6-9
- 英文摘要9-13
- 符号说明13-16
- 前言16-18
- 实验材料18-25
- 实验方法25-41
- 结果41-45
- 讨论45-53
- 结论53-54
- 附录I表格（Tables)54-56
- 附录 II Figures56-72
- 参考文献72-80
- 学位论文评阅及答辩情况表80
【二级参考文献】
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，本文编号：675436
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