可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂（sGC003）对心肌肥大的作用及其机制研究

发布时间：2017-08-18 23:10

  本文关键词：可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂（sGC003）对心肌肥大的作用及其机制研究

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【摘要】：研究意义及目的:心肌肥大是多种心血管疾病,如高血压、心肌梗塞、缺血性心脏病、心瓣膜病等的共同病理过程,被认为是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立危险因素。因此,改善心肌肥大对多种心血管疾病的治疗有着重要意义。目前针对心肌肥大的治疗药物主要是基于抑制肾素-血管紧张素系统,尽管具有一定疗效,但该类药物大多只是减缓了心肌肥大发生发展的过程,而不能逆转其发展进程,故亟待寻找新的药物干预靶点。可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,s GC)在一氧化氮(nitric oxide,NO)信号转导通路中发挥着关键性的作用。NO激活s GC,活化的s GC催化三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)反应生成第二信使环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,c GMP),介导许多生理过程,如促进血管和平滑肌舒张,抑制血小板凝聚、血管重构、细胞凋亡和炎症发生,参与神经传递等。s GC在心血管系统表达丰富,已有许多研究证明在心血管疾病的发生发展过程中s GC表达量及活性有显著变化,为其作为心血管疾病的治疗靶点提供了一定的理论依据。由德国拜耳先灵制药公司研发的s GC刺激剂riociguat已获得美国、欧盟及日本在内的多个国家批准,用于治疗成人动脉型肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)和慢性血栓栓塞型肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH),是第一个以s GC为靶点的肺动脉高压治疗药物。s GC003是我所药物合成研究室以riociguat为先导化合物进行结构改造并筛选得到的具有自主知识产权的全新结构化合物。本室前期药效学评价研究表明,在慢性缺氧及野百合碱诱导的SD大鼠肺动脉高压模型上,预防给予s GC003能显著降低大鼠肺动脉压,降低右心指数,改善右心肥大,具有良好的药理作用。但除了降低肺动脉压的代偿作用外,s GC003是否存在独立的心脏活性作用而直接改善心肌肥大的可能性尚未验证。为此,本课题在离体水平观察了s GC003对心脏的直接作用和对心肌细胞肥大的影响,并对其可能机制进行了探讨,期望为s GC003临床适应证的选择提供一定的实验依据。方法:1.采用Langendorff离体心脏灌流模型,观察s GC003对正常SD大鼠离体心脏冠脉流量、心率(HR)、左室内压(Pmax)、左室发展压(LVDP)、左室压最高值与心率乘积(RPP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)等心功能指标的影响。2.采用慢性缺氧2 wk诱导SD大鼠右心肥大。缺氧处理后利用Langendorff灌流模型,观察s GC003对右心肥大SD大鼠离体心脏的冠脉流量、HR、Pmax、LVDP、RPP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等心功能指标的影响。灌流结束后,分离右心室自由壁,左心室与室间隔,分别称重,计算右心指数判断右心肥大程度。3.采用混合酶消化法及差速贴壁法分离并纯化SD乳鼠心肌细胞,用工具药内皮素-1(endothelin-1,ET-1)10-8 mol/L刺激建立心肌细胞肥大模型,以riociguat为阳性对照,伴随给予s GC003 10-8、10-7、10-6 mol/L,48 h后在倒置显微镜下观察心肌细胞形态,图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)对心肌细胞表面积进行测量分析,BCA法检测心肌细胞总蛋白含量,实时定量PCR法检测心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)m RNA表达。4.采用酶联免疫吸附法检测s GC003刺激SD乳鼠心肌细胞c GMP的生成量,明确s GC003对s GC活性的影响。5.采用免疫荧光法检测s GC003对SD乳鼠心肌细胞活化的T细胞核因子(NFATc4)核转位的影响,用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)分析NFATc4细胞核、质荧光强度的比值。结果:1.s GC003对正常SD大鼠离体心脏的作用:s GC003 10-6、10-4 mol/L能显著地增加正常SD大鼠离体心脏的冠脉流量、Pmax、LVDP、RPP、+dp/dtmax、-dp/dtmax(P0.05),具有良好的量效关系,对心率无显著影响(P0.05)。2.s GC003对右心肥大SD大鼠离体心脏的作用:慢性缺氧使SD大鼠右心指数显著增加(P0.001),造成了SD大鼠右心肥大。s GC003显著增加右心肥大SD大鼠心脏的冠脉流量,对Pmax、LVDP、RPP、+dp/dtmax、-dp/dtmax表现出升高的趋势,但无统计学差异(P0.05),对心率无影响(P0.05)。3.s GC003对ET-1诱导的心肌细胞肥大的影响:与对照组相比,ET-1 10-8 mol/L刺激心肌细胞48 h,可使心肌细胞表面积增加80%(P0.001),总蛋白含量增加120%(P0.01),ANP m RNA水平升高140%(P0.01)。伴随给予s GC003 10-8、10-7、10-6 mol/L能浓度依赖地对抗ET-1引起的心肌细胞表面积增大(P0.01)和总蛋白质含量升高(P0.05),对于ET-1诱导的ANP m RNA再表达也有一定抑制作用(P0.05),其作用与对照药物riociguat相当。4.s GC003 10-7 mol/L使心肌细胞c GMP含量显著升高4倍以上,由3.61 pmol/m L增加至14.66 pmol/m L(P0.001),预先给予s GC抑制剂ODQ处理组相比s GC003单独处理组c GMP含量显著下降(P0.05)。5.ET-1 10-8 mol/L刺激NFAT转位入核,细胞核荧光强度与细胞质荧光强度的比值显著增加(P0.001),s GC003 10-7 mol/L减弱ET-1引起的核内荧光增强(P0.001),给予ODQ和PKG抑制剂KT5823分别抑制了s GC003的作用,核质荧光强度比值增加(P0.001)。结论:1.s GC003增加离体心脏冠脉流量,营养心肌;并提高其收缩、舒张功能。2.s GC003抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大。3.s GC003的作用与s GC-c GMP-PKG-NFAT途径相关。
【关键词】：可溶性鸟苷酸环化酶 刺激剂 sGC003 心肌肥大 心肌细胞
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-18
• 第一部分 sGC003对离体心脏的作用18-32
• 一、实验材料18
• 二、实验方法18-20
• 三、实验结果20-30
• 1. sGC003对正常SD大鼠心脏的作用20-24
• 1.1 sGC003对正常SD大鼠心脏冠脉流量的影响20-21
• 1.2 sGC003对正常SD大鼠心率的影响21-22
• 1.3 sGC003对正常SD大鼠心脏收缩功能的影响22-24
• 1.4 sGC003对正常SD大鼠心脏舒张功能的影响24
• 2. sGC003对慢性缺氧诱导右心肥大SD大鼠心脏的作用24-30
• 2.1 慢性缺氧对SD大鼠右心指数的影响24
• 2.2 慢性缺氧对心功能指标的影响24-26
• 2.3 sGC003对右心肥大SD大鼠心脏冠脉流量的影响26
• 2.4 sGC003对右心肥大SD大鼠心脏心率的影响26-27
• 2.5 sGC003对右心肥大SD大鼠心脏收缩功能的影响27-29
• 2.6 sGC003对右心肥大SD大鼠心脏舒张功能的影响29-30
• 四、讨论30-32
• 第二部分 sGC003对内皮素诱导的心肌细胞肥大的作用32-46
• 一、实验材料32-33
• 二、实验方法33-37
• 三、实验结果37-44
• 1. 心肌细胞生长状况及形态37-38
• 2. ET-1 刺激心肌细胞肥大模型的建立38-40
• 2.1 ET-1 对心肌细胞表面积的影响38-39
• 2.2 ET-1 对心肌细胞ANP mRNA的影响39-40
• 3. sGC003对ET-1 诱导的心肌细胞肥大的作用40-44
• 3.1 sGC003对肥大心肌细胞表面积的影响40
• 3.2 sGC003对肥大心肌细胞ANP mRNA表达量的影响40-41
• 3.3 sGC003对肥大心肌细胞总蛋白含量的影响41-44
• 四、讨论44-46
• 第三部分 sGC003作用于内皮素诱导的心肌细胞肥大的机制研究46-54
• 一、实验材料46
• 二、实验方法46-49
• 三、实验结果49-52
• 1. sGC003刺激cGMP生成49
• 2. sGC003对NFATc4核转位的影响49-52
• 四、讨论52-54
• 结论54-55
• 参考文献55-62
• 个人简历62-63
• 致谢63

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