氨基酸代谢轮廓耦合RT-PCR分析诱变菌株高效发酵雷帕霉素

发布时间：2017-08-20 00:00

  本文关键词：氨基酸代谢轮廓耦合RT-PCR分析诱变菌株高效发酵雷帕霉素

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【摘要】：雷帕霉素(Rapamycin)是一种天然的大环内酯类抗生素,具有各种各样的生物活性,例如抗真菌、免疫抑制剂、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等。在临床上被用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗,相比环孢菌素而言,雷帕霉素表现出更强的临床药用价值和更低的毒副作用,因此雷帕霉素的研究备受学术界和各大制药企业的青睐与关注。1.根据以前文献报道[1],莽草酸的添加能够提高雷帕霉素的产量,本文从吸水链霉菌诱变菌株U2-3D9出发,进行新一轮紫外诱变筛选获得一株雷帕霉素莽草酸耐受菌株U3-SD,其产量达到389.7 mg/L,相比诱变菌株U2-3D9(273 mg/L),雷帕霉素产量提高了42.7%。2.虽然通过紫外诱变获得了一株雷帕霉素高产菌株,但是雷帕霉素高产机制仍然不清楚,而且通过比较吸水链霉菌诱变菌U3-SD与原始菌ATCC 29253胞外发酵特性,结果仍然无法揭示雷帕霉素的高产机制。为了剖析雷帕霉素生产机理并用于强化其合成,利用氨基酸代谢轮廓分析比较原始菌与诱变菌株U3-SD之间胞内氨基酸库变化来揭示限制雷帕霉素的合成因素。首先在气相色谱-质谱联用仪的检测下86种代谢物被鉴定,然后采用主成分分析、层聚类分析和偏最小二乘法分析发现原始菌和诱变菌之间存在代谢差异,同时发现与雷帕霉素合成相关的潜在生物标志物有22种,最后在此基础上通过代谢途径分析发现氨基酸代谢在雷帕霉素合成中具有重要的作用,包括赖氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鸟氨酸。3.在氨基酸代谢轮廓分析指导下,采用HPLC检测细胞内上述7种氨基酸胞内绝对含量,发现诱变菌细胞内氨基酸代谢供应不足,即“氮饥饿现象”,且与原始菌之间浓度差异最显著的是赖氨酸。为了验证赖氨酸代谢是雷帕霉素合成的关键代谢模块,采用实时荧光定量PCR和酶活检测分析赖氨酸代谢途径上的关键酶(二氢吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和赖氨酸环化脱氨酶),结果发现诱变菌赖氨酸代谢途径上关键酶的基因转录水平和酶活均提高了,表明这三个酶与雷帕霉素合成具有正相关性,在理性指导下通过添加不同浓度的赖氨酸进行雷帕霉素的高效发酵,结果当添加5 g/L赖氨酸时,诱变菌株U3-SD的雷帕霉素产量从389.7 mg/L上升至435.7 mg/L。
【关键词】：代谢轮廓 实时荧光定量PCR 二氢吡啶二羧酸合酶 雷帕霉素 吸水链霉菌
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R978.1
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-25
• 1.1 引言10-11
• 1.2 雷帕霉素及其衍生物11-15
• 1.2.1 雷帕霉素理化性质11
• 1.2.2 雷帕霉素临床作用机理和应用11-12
• 1.2.3 雷帕霉素及其衍生物合成机理12-13
• 1.2.4 雷帕霉素菌种选育13-15
• 1.3 微生物代谢组学15-22
• 1.3.1 代谢组学与系统生物学15-16
• 1.3.3 代谢组学分析方法16-21
• 1.3.4 代谢组学的应用21-22
• 1.4 实时荧光定量PCR技术及其应用22-23
• 1.4.1 实时荧光定量PCR的分类与比较22-23
• 1.4.2 实时荧光定量PCR技术的应用23
• 1.5 本文研究的内容和意义23-25
• 第二章 雷帕霉素紫外诱变高产菌的氨基酸代谢轮廓分析25-53
• 2.1 材料与仪器设备25-28
• 2.1.1 菌种25
• 2.1.2 药品25-27
• 2.1.3 仪器设备27-28
• 2.2 实验方法28-35
• 2.2.1 培养基及培养方法28-29
• 2.2.2 雷帕霉素检测方法29-30
• 2.2.3 紫外诱变与筛选30-31
• 2.2.4 总糖的测定31-33
• 2.2.5 细胞干重的测定33
• 2.2.6 GC-MS样品的提取及测定方法33-34
• 2.2.7 数据处理34-35
• 2.3 实验结果与讨论35-51
• 2.3.1 高产菌株的诱变筛选与培养基优化35-37
• 2.3.2 原始菌与诱变菌胞外发酵特性动态变化37-38
• 2.3.3 与雷帕霉素合成相关的胞内关键生物标志物及代谢模块确定38-48
• 2.3.4 氨基酸代谢模块分析48-51
• 2.4 本章小结51-53
• 第三章 赖氨酸代谢途径关键酶分析与雷帕霉素高效发酵53-69
• 3.1 实验材料53-56
• 3.1.1 菌种、质粒及引物53-54
• 3.1.2 主要试剂54-55
• 3.1.3 主要溶液55
• 3.1.4 主要仪器与设备55-56
• 3.2 实验方法56-63
• 3.2.1 培养基及培养方法56
• 3.2.2 氨基酸的HPLC测定56-57
• 3.2.3 引物设计及基因测序57-58
• 3.2.4 目的基因片段的获得58-60
• 3.2.5 吸水链霉菌mRNA的提取及检测方法60-62
• 3.2.6 酶活检测62-63
• 3.2.7 数据处理63
• 3.3 实验结果与讨论63-67
• 3.3.1 胞内氨基酸绝对定量分析及比较63-64
• 3.3.2 赖氨酸代谢途径上关键酶的实时荧光定量PCR转录分析64-65
• 3.3.3 赖氨酸代谢途径上关键酶的酶活检测分析65-66
• 3.3.4 赖氨酸与雷帕霉素合成之间关系及雷帕霉素高效发酵66-67
• 3.4 小结67-69
• 第四章 结论与展望69-71
• 4.1 结论69
• 4.2 创新点69-70
• 4.3 展望70-71
• 参考文献71-79
• 发表论文和参加科研情况说明79-80
• 致谢80-81

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本文编号：703582