硅烷凝胶改性及应用于固定化脂肪酶的研究

发布时间：2017-08-22 11:39

  本文关键词：硅烷凝胶改性及应用于固定化脂肪酶的研究

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【摘要】：溶胶-凝胶(Sol-gel)固定生物大分子是以四乙氧基硅烷(TEOS)或四甲氧基硅烷(TMOS)等硅氧烷前驱体为原料,通过一系列水解、缩合(缩聚)、老化形成凝胶网络的过程,在此过程中,凝胶围绕生物大分子并将其包埋其中。由于TEOS固定脂肪酶存在生物相容性较差等问题,因此本论文选用丙三醇改性TEOS并得到了生物亲和性较好的硅烷凝胶前体,然后以此进行固定化酶的研究,研究了固定化酶过程中的固定化工艺;并且对脂肪酶采用生物印迹方式诱导然后再进行固定化的研究,制备得到了酯化活性较高的丙三醇改性硅烷凝胶固定化生物印迹脂肪酶。首先,论文选用丙三醇改性TEOS得到亲水性硅烷凝胶前体,以改性后的产物溶解性为考察指标,采用红外光谱以及13C-NMR和1H-NMR进行化学表征,得到了丙三醇改性硅烷凝胶前体的最佳制备工艺:选择无溶剂体系进行反应,底物TEOS为50 m L,TEOS:丙三醇为1:0.25(mol:mol),5g 732型强酸性阳离子交换树脂,反应温度为50℃,水浴振荡器振荡速率选择为180 rpm,反应时间72 h。在此最适宜条件下制备得到的硅烷凝胶前体具有较好的亲水性,溶解性达到0.58 g/mL。然后,以丙三醇改性TEOS得到的亲水性硅烷凝胶前体为载体,进行了对假丝酵母脂肪酶固定化的工艺研究,以固定化酶催化酯化活性为考察指标,得到了固定化脂肪酶的最佳固定化工艺:0℃冰水混合浴条件下,改性硅烷凝胶与脂肪酶质量比为3:1,pH 7.8的磷酸盐缓冲液,80 mg致孔剂聚乙烯醇600(PEG 600),250μL硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。采用该条件下制备得到的改性硅烷凝胶固定化脂肪酶,其催化酯化活性是游离脂肪酶的1.42倍。最后,采用改性后的硅烷凝胶前体对生物印迹脂肪酶进行了固定化处理,通过固定化的方式保持印迹过程中酶与印迹配体结合时所处的最佳催化空间构象,探究了生物印迹过程对固定化印迹脂肪酶催化酯化活性的影响。讨论了固定化生物印迹脂肪酶印迹过程中的最佳工艺:选择橄榄油和棕榈酸甲酯双底物作为印迹模板,脂肪酶与印迹模板质量比为5:2、乙醇做助溶剂(印迹模板与助溶剂质量比为1:2),吐温-80(Tween80)作为表面活性剂,其用量为15 mg/mL,90 W功率超声辅助印迹6 min分钟、选择正己烷作为模板洗脱剂并采用超声去除模板。在该条件下制备得到的改性硅烷凝胶固定化生物印迹脂肪酶催化酯化活性是游离酶的3.84倍,是生物印迹脂肪酶的1.65倍。
【关键词】：硅烷改性 脂肪酶 固定化 生物印迹 酯化
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文献综述11-29
• 1.1 脂肪酶简介11-12
• 1.2 脂肪酶的固定化技术12-13
• 1.3 溶胶-凝胶固定生物大分子13-18
• 1.3.1 溶胶-凝胶固定生物大分子原理及过程13-15
• 1.3.2 溶胶-凝胶法固定化酶的特点15-17
• 1.3.3 改性硅烷凝胶制备过程及特点17-18
• 1.4 生物印迹技术18-25
• 1.4.1 生物印迹概念的提出及发展18-19
• 1.4.2 生物印迹脂肪酶原理及分类19-22
• 1.4.3 生物印迹技术研究进展22-25
• 1.5 溶胶-凝胶固定生物印迹脂肪酶25-27
• 1.5.1 溶胶-凝胶固定生物印迹脂肪酶的原理25-26
• 1.5.2 溶胶-凝胶固定生物印迹脂肪酶的制备方法26-27
• 1.5.3 溶胶-凝胶固定生物印迹脂肪酶的研究进展27
• 1.6 论文选题目的及意义27-29
• 第二章 改性硅烷凝胶前体的制备及条件优化29-43
• 2.1 引言29-30
• 2.2 试剂与仪器30
• 2.2.1 试剂30
• 2.2.2 仪器30
• 2.3 实验方法30-32
• 2.3.1 丙三醇改性硅烷凝胶前体的合成30
• 2.3.2 丙三醇改性硅烷凝胶前体合成的条件优化30-32
• 2.3.3 丙三醇改性硅烷凝胶前体的分析检测32
• 2.4 结果与讨论32-42
• 2.4.1 反应介质的选择32-33
• 2.4.2 原料摩尔比的选择33-34
• 2.4.3 反应温度的选择34-35
• 2.4.4 反应时间的选择35-36
• 2.4.5 固体酸催化剂的用量的选择36
• 2.4.6 反应底物用量研究36-37
• 2.4.7 恒温水浴振荡器的振荡速率研究37-38
• 2.4.8 前体的化学表征38-41
• 2.4.9 不同溶解性能的丙三醇改性硅烷凝胶前体的红外光谱比较41-42
• 2.5 本章结论42-43
• 第三章 改性硅烷凝胶对假丝酵母脂肪酶活性的影响研究43-56
• 3.1 引言43
• 3.2 试剂与仪器43-44
• 3.2.1 试剂43-44
• 3.2.2 仪器44
• 3.3 实验方法44-46
• 3.3.1 假丝酵母脂肪酶液的制备44
• 3.3.2 丙三醇改性硅烷凝胶前体的合成44
• 3.3.3 假丝酵母脂肪酶的固定化44-45
• 3.3.4 改性硅烷凝胶固定化脂肪酶酯化活力的测定45-46
• 3.4 结果与讨论46-55
• 3.4.1 缓冲液pH对固定化酶活性的影响46
• 3.4.2 固定化水浴温度对固定化酶活性的影响46-47
• 3.4.3 凝胶用量对固定化酶活性的影响47-48
• 3.4.4 干燥方式对固定化酶活性的影响48-49
• 3.4.5 干燥时间对固定化酶和游离酶催化酯化反应的影响49-50
• 3.4.6 PEG种类与用量对固定化过程中酶活性的影响50-51
• 3.4.7 APTES对固定化过程中酶活性的影响51-52
• 3.4.8 老化时间对固定化酶活性的影响52-53
• 3.4.9 固定化酶与游离酶酯化活性的研究53-55
• 3.5 本章结论55-56
• 第四章 改性硅烷凝胶固定化印迹脂肪酶催化酯化活性的研究56-71
• 4.1 前言56
• 4.2 试剂与仪器56-57
• 4.2.1 试剂56
• 4.2.2 仪器56-57
• 4.3 实验方法57-58
• 4.3.1 固定化生物印迹脂肪酶的制备57-58
• 4.3.2 改性硅烷凝胶固定化印迹酶酯化活力的测定58
• 4.3.3 固定化酶和游离酶催化酯化活性的比较58
• 4.4 结果与讨论58-70
• 4.4.1 生物印迹模板对固定化生物印迹酶酯化活性的影响58-60
• 4.4.2 助溶剂对固定化生物印迹酶酯化活性的影响60-61
• 4.4.3 表面活性剂对固定化生物印迹酶酯化活性的影响61-63
• 4.4.4 生物印迹时间和温度对固定化生物印迹酶活性的影响63-66
• 4.4.5 超声辅助印迹对固定化生物印迹酶酯化活性的影响66-67
• 4.4.6 双底物模板诱导对固定化生物印迹酶活性的影响67-68
• 4.4.7 模板洗脱方式对固定化生物印迹酶活性的影响68-69
• 4.4.8 固定化印迹酶与游离酶酯化活性的研究69-70
• 4.5 本章结论70-71
• 第五章 结论与展望71-73
• 5.1 结论71-72
• 5.2 展望72-73
• 参考文献73-81
• 硕士期间发表的论文81-82
• 致谢82

【参考文献】

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本文编号：718965