氟康唑和钙通道阻滞剂联合对抗耐药白色念珠菌的作用及机制研究

发布时间：2017-08-22 19:03

  本文关键词：氟康唑和钙通道阻滞剂联合对抗耐药白色念珠菌的作用及机制研究

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【摘要】：近年来,侵袭性真菌感染在一些免疫力低下者的人群(如肿瘤患者,器官移植、导管插管患者及艾滋病患者等)中的发生率越来越高。这些临床分离的侵袭性真菌中,念珠菌占有较高的比例,其中白色念珠菌引起的感染是念珠菌感染的主要组成部分。唑类抗真菌药物尤其是氟康唑,凭借其安全、有效、价廉和低毒的特性成为预防和治疗白色念珠菌所引起感染的首选药。然而,随着氟康唑在临床治疗中的频繁使用,真菌的耐药现象也随之而来,给临床治疗深部真菌感染带来极大的挑战。研究一个新的抗菌药物需要巨大的经济投入,强大的研究队伍,而且将会耗时多年,因此,联合用药成为克服真菌耐药的有效策略之一。近年来研究表明,许多非抗真菌药物自身虽无强大的抗真菌作用,但能明显增加唑类药物的敏感性,这对于克服真菌耐药性无疑是一种有效的途径,也为新药开发提供了新的线索与思路。唑类抗真菌药物在临床上治疗深部侵袭性真菌病的应用非常广泛,如果能通过联合用药的途径,从已用于临床的非抗真菌药物中筛选出能够增加唑类抗真菌药物敏感性的有效药物,这对于增加唑类这一安全、价廉的抗真菌药物的临床作用效果,意义重大。钙稳态是白色念珠菌正常生长的基础,钙离子不仅参与胞内基础代谢,还能维持内质网、高尔基体等重要细胞器的生理功能,而且钙离子还可作为一种多功能信号载体调节白色念珠菌细胞的多种活动,包括形态发生、环境压力应答以及致病性等。钙通道阻滞剂(Calcium channel blockers, CCBs)为临床常用药物,安全性好,近年来许多研究表明多种钙通道阻滞剂单用或与唑类抗真菌药物联合应用均有明显抗白色念珠菌作用,如硝苯地平和维拉帕米单用能够抑制白念芽管形成,维拉帕米,硝苯地平和尼莫地平能增强酮康唑抗真菌作用,维拉帕米与氟康唑联用在对抗白色念珠菌生物被膜方面也具有协同作用。由此可见,钙通道阻滞剂在抗真菌领域有着广泛的应用前景,若能进一步将其抗真菌机制研究透彻,必然会为发展新的抗真菌方法提供重要思路。此外,我们观察到,目前国内外围绕钙通道阻滞剂的抗真菌实验研究虽然较多,但是对临床常用的这几种该通道阻滞药如氨氯地平,硝苯地平,贝尼地平和氟桂利嗪与氟康唑联合抗真菌的作用却没有研究。本实验选取临床常用的这四种钙通道阻滞剂,观察其与氟康唑的联合抗白色念珠菌作用,发现该组合表现出强烈协同作用,因此又对两类药物的协同作用机制进行了深入的探讨与研究。若能将钙通道阻滞剂与氟康唑药物的协同抗耐药白色念珠菌机制研究透彻,不仅能扩大钙通道阻滞剂的临床应用范围,还将对抗真菌耐药的研究产生重大的理论依据与现实意义。1.氟康唑和钙通道阻滞剂联合抗白念的作用研究参照CLSI M27-A3方案中的棋盘法,用对倍稀释的方法配制系列浓度的钙通道阻滞剂(氨氯地平,硝苯地平,贝尼地平和氟桂利嗪)和氟康唑。分别吸取50微升的氟康唑和钙通道阻滞剂类药物加入96孔板各个孔内,再往各含药孔中分别加入提前配好的终浓度约为1×103 CFU/ml的白念,在35度恒温培养箱内静置培养24h,用XTT-甲萘醌避光负载2h,用酶标仪测OD值,以真菌生长达到80%抑制时为判读终点,用分数抑菌浓度指数(FICI)法和非参数反应面(AE)法分别评价药物联用结果。结果显示氨氯地平,硝苯地平,贝尼地平和氟桂利嗪与氟康唑联用对耐药白念的FIC1分别为0.017,0.019,0.035和0.033,均远远小于0.5,正负AE值相加之和远大于200%,证明这两类药物联合对耐药白念的显著协同作用。但对敏感白念无协同作用。于不同的EP管中分别加入CA10菌悬液,并加入一定浓度的不同药物及组合,以XTT法分别测定不同时间点药物作用的效果。以时间为横坐标,以所测OD值为纵坐标,绘制不同药物组合对CA1O的时间杀菌曲线图。结果发现,与生长对照组相比,6h之后各含氟康唑的组开始出现生长延迟,其中氟康唑和氨氯地平联用组处理的真菌生长延迟最明显,再次验证了氨氯地平,硝苯地平,贝尼地平和氟桂利嗪与氟康唑的联合抗耐药白色念珠菌的协同作用。2.氟康唑和钙通道阻滞剂联用对真菌细胞内钙浓度的影响选取体外作用研究中与氟康唑协同效果最好钙通道阻滞剂氨氯地平为主要受试药。于10ml无菌离心管中过夜培养一定浓度的CA10菌液,离心收集菌细胞,用不含钙的D-Hanks缓冲液清洗三次,再用D-Hanks缓冲液重悬,滤过分散细胞(300目尼龙网),调节菌液浓度为1×107CFU/ml,将调节后的菌液与终浓度为6μM的Fluo-3/AM在37-C下120rpm振荡,避光负载50min,加入氨氯地平和氟康唑的单药或组合药后上机用流式细胞仪测各组胞内荧光强度,来反映细胞内钙浓度。结果表明,和生长对照组相比,氨氯地平或氟康唑单用组中CA10细胞内钙离子几乎无变化,两种药物联用组中CA10细胞内钙离子浓度则有升高趋势。由此可以推测,两药联用对抗耐药白色念珠菌的协同机制可能与真菌细胞内钙离子紊乱有关。3.氟康唑和钙通道阻滞剂联用对白色念珠菌细胞内钙通道相关基因表达的影响为进一步探讨和研究两药联用导致CA10细胞内钙浓度升高的原因,本实验仍是以钙通道阻滞剂中的氨氯地平与氟康唑作为受试药,用热酚法提取两药单用或联用处理后CA10的总RNA,并设置不加药的对照组。分别采用普通反转录PCR(reverse transcription PCR)和实时定量PCR(Real Time-PCR,RT-PCR)的方法对钙信号通路中编码细胞膜上钙通道的基因(CCH1,MID1),编码钙调磷酸酶的基因(CNA1,CNB1)和编码液泡膜上介导细胞内高浓度钙进入液泡内的钙通道基因(YVCl)的表达量进行测定。结果表明,与对照组和单用组相比,两药联用组对CCHl和MID1的表达量无明显影响,却惊喜的发现联用组和能引起CNA1,CNB1和YVC1基因表达量的降低,尤其是CNA1的基因表达量,降低量最为明显。由此我们可以推测,氨氯地平和氟康唑联合的协同作用机制可能与抑制了(CNA1,CNB1,YVC1基因的表达有关。从而引起对钙离子平衡调控起着重要作用的钙调磷酸酶的功能和介导细胞内高浓度钙进入液泡的钙通道受抑,导致CA10细胞内钙浓度的升高。4.钙通道阻滞剂对氟康唑的耐药基因及蛋白的表达和功能的影响由于药物外排增加是白色念珠菌最常见的耐药机制之一,本实验分别利用PCR技术和罗丹明6G外排实验从基因表达水平的变化和蛋白活性的变化两个角度探究钙通道阻滞剂氨氯地平等是否减弱了耐药真菌对氟康唑的外排。通过热酚法提取CA10的总RNA,反转录成cDNA,用普通PCR和RT-PCR定性和定量测定的外排耐药基因CDR1,CDR2和MDR1的表达变化。并利用罗丹明6G作为药物外排的底物,探究钙通道阻滞剂的加入是否抑制了真菌外排泵的活性。实验结果发现,与对照组相比,氨氯地平和氟康唑单用或联用对CDR1,CDR2和MDR1表达量的影响均无显著差异。且罗丹明6G实验表明钙通道阻滞剂的加入并不能影响药物的外排泵的活性。由此我们推测,钙通道阻滞剂和氟康唑联合协同作用机制与减弱药物外排无关。综上所有实验证明,氨氯地平,硝苯地平,贝尼地平和氟桂利嗪和氟康唑联合抗白色念珠菌具有强协同作用。协同作用机制可能与抑制了真菌细胞内编码钙调磷酸酶的基因(CNA1, CNB1)和编码液泡膜上介导高浓度钙进入液泡的该通道基因(YVC1)的表达有关,从而引起钙调磷酸酶的活性下降,介导细胞内高浓度钙进入液泡的钙通道受抑,钙平衡失调,浓度升高。
【关键词】：白色念珠菌 耐药 氟康唑 钙通道阻滞剂 联合用药 机制研究
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-18
• 符号说明18-20
• 前言20-26
• 第一章 氟康唑和钙通道阻滞剂联合抗真菌作用研究26-41
• 1 材料26-29
• 1.1 药品与主要试剂26-27
• 1.2 药品与主要试剂和培养基的配制27
• 1.3 主要仪器27-29
• 1.4 实验菌株29
• 2 内容与方法29-32
• 2.1 氟康唑与钙通道阻滞剂联合抗真菌静态作用测定29-31
• 2.1.1 菌液制备29
• 2.1.2 微量稀释法29-30
• 2.1.3 评价方法与结果判定30-31
• 2.2 氟康唑与钙通道阻滞剂联合抗真菌动态作用测定31-32
• 2.2.1 药液和菌液制备31
• 2.2.2 时间-杀菌曲线的绘制31
• 2.2.3 评价方法与结果判定31-32
• 3 氟康唑与钙通道阻滞剂的联合抗真菌作用结果32-39
• 3.1 氟康唑与钙通道阻滞剂的联合抗真菌静态作用结果32-38
• 3.1.1 氟康唑与钙通道阻滞剂联合的最低有效菌浓度32-35
• 3.1.2 FICI法评价FLC/AML、NIF、BEN和FNZ的协同作用35-37
• 3.1.3 △E法评价FLC/AML、NIF、BEN和FNZ的协同作用37-38
• 3.2 氟康唑与钙通道阻滞剂的联合抗真菌动态作用结果38-39
• 4 讨论39-40
• 5 结论40-41
• 第二章 氟康唑和钙通道阻滞剂联用对真菌细胞内钙浓度的影响41-48
• 1 材料41-43
• 1.1 药品与主要试剂41-42
• 1.2 药品与主要试剂和培养基的配制42
• 1.3 仪器42-43
• 1.4 实验菌株43
• 2 实验内容与方法43-44
• 2.1 菌液配置43-44
• 2.2 负载荧光染料44
• 2.3 实验分组44
• 2.4 流式细胞术测定钙离子浓度44
• 3 结果44-45
• 4 讨论45-47
• 5 结论47-48
• 第三章 氟康唑和钙通道阻滞剂联用对白色念珠菌细胞内钙通道相关基因表达的影响48-59
• 1 材料48-50
• 1.1 药品与主要试剂48-49
• 1.2 药品与主要试剂和培养基的配制49
• 1.3 仪器49-50
• 1.4 实验菌株50
• 2 试验内容与方法50-55
• 2.1 菌系统准备50-51
• 2.1.1 菌液稀释50
• 2.1.2 菌液体系的配制与培养50-51
• 2.2 热酚法提取总RNA51-52
• 2.3 反转录合成cDNA52
• 2.4 PCR扩增52-53
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳53
• 2.6 实时荧光定量PCR(RT-PCR)53-55
• 3 实验结果55-57
• 3.1 普通PCR测定基因表达量的结果55-56
• 3.2 RT-PCR测定基因表达量的结果56-57
• 4 讨论57-58
• 4.1 钙通道相关基因的选取57
• 4.2 普通PCR和RT-PCR的比较57-58
• 5. 结论58-59
• 第四章 钙通道阻滞剂对氟康唑的耐药基因及蛋白的表达和功能的影响59-66
• 1 材料59-61
• 1.1 药品与主要试剂59-60
• 1.2 药品与主要试剂和培养基的配制60
• 1.3 仪器60-61
• 1.4 实验菌株61
• 2. 试验内容与方法61-62
• 2.1 常见耐药基因的表达量测定61
• 2.2 白色念珠菌外排泵活性测定61-62
• 2.2.1 菌液的制备61-62
• 2.2.2 药物外排荧光测定62
• 3 实验结果62-64
• 3.1 药物对白念外排耐药基因表达量的影响结果62-63
• 3.2 药物对白色念珠菌外排泵蛋白活性的影响结果63-64
• 4 讨论64-65
• 5 结论65-66
• 全文小结66-68
• 参考文献68-76
• 致谢76-77
• 攻读硕士学位期间发表论文及参编书籍77-78
• 附件78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 庄明明,温奕欣,刘少列,洪晓鹏;流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度[J];西安交通大学学报(医学版);2005年05期

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本文编号：720831