微生物羰基还原酶催化法合成磷酸西他列汀关键手性中间体

发布时间：2017-08-23 21:13

本文关键词：微生物羰基还原酶催化法合成磷酸西他列汀关键手性中间体

【摘要】：利用生物催化法制备光学活性化合物已经成为当今的研究热点之一。微生物羰基还原酶催化前手性羰基还原合成手性醇,已成为手性药物及其中间体的重要合成途径。本文对利用微生物羰基还原酶催化法不对称还原4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(2)合成抗Ⅱ型糖尿病药物磷酸西他列汀关键手性中间体(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-,三氟苯基)丁-1-酮((S)-1)进行了研究,实现了(S)-1高效、高对映选择性的制备。采用分级筛选模型,从125份土壤样品中分离出能够以苯乙酮为唯一碳源生长的89个菌株。其中24个菌株能够将前手性酮2还原为1。编号为40-1的菌株表现出最高的羰基还原酶活性和对映选择性,被选为后续研究的目标菌株。该菌株经16S rDNA序列比对分析,将其鉴定为Pseudomonas pseudoalcaligenes,命名为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)XW-40。利用响应面与单因素法对类产碱假单胞菌XW-40产羰基还原酶的发酵条件进行优化。得出最佳培养基组成及培养条件为:D-果糖13 g/L,牛肉膏11.2 g/L,蛋白胨28 g/L,NaCl 4.6 g/L,MgSO4?7H2O 1.2 g/L,KH2PO4 1.0 g/L,pH为7.0,培养温度为30℃,摇床转速为180 r/min,培养时间为36 h。在优化的条件下,类产碱假单胞菌XW-40菌株所产的羰基还原酶活力达326 U/g(干重细胞),较优化前提高了23%。通过对该菌株还原2制备(S)-1工艺的优化,确定最佳的底物浓度为10 g/L,细胞浓度为80 g(干重)/L,辅底物为5%(w/v)葡萄糖,助溶剂为10%(v/v)DMSO;最佳pH为7.0,温度为30℃,摇床转速为180 r/min,反应时间为24 h。在最佳条件下反应,产率99%,ee值99%。进一步对细胞的重复利用进行研究,结果发现5个批次后的收率仍为47%,即在1L的反应体系中使用同一批次的细胞,可以生成的产物量高达37.4 g。为了提高底物的初始浓度与减少反应中底(产)物对羰基还原酶的抑制作用,采用树脂原位吸附技术,将底物先吸附于大孔树脂XAD-7上再加入反应体系进行转化。使用此树脂原位吸附策略,使得底物初始浓度由10 g/L提高至25 g/L,反应45 h后,产率为90.5%,ee值99%。为提高生物催化剂的稳定性,对类产碱假单胞菌XW-40细胞的海藻酸钠包埋固定化工艺进行了初步研究。得到最佳的固定化条件为:海藻酸钠浓度为1.5%(w/v),CaCl2的浓度为3%(w/v),细胞的包埋浓度为16%(w/v),固定化时间为6 h。采用在此最佳条件制得的固定化细胞进行还原2合成(S)-1的反应,底物的浓度为10 g/L,细胞终浓度80 g/L,反应时间35 h,产率为98.8%,ee值99%。
【关键词】：生物还原 西他列汀 类产碱假单胞菌XW-40 树脂原位吸附 固定化
【学位授予单位】：重庆邮电大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914.5
【目录】：

摘要3-5
Abstract5-10
第1章绪论10-21
1.1 糖尿病与糖尿病药物简介10
1.2 西他列汀10-14
1.2.1 西他列汀化学名与结构10-11
1.2.2 西他列汀作用机理11
1.2.3 西他列汀的合成11-14
1.3 生物催化及其在手性药物合成中的应用14-19
1.3.1 手性与生物催化14-15
1.3.2 羰基还原酶15-19
1.4 本课题的研究意义与主要内容19-21
1.4.1 研究意义19
1.4.2 研究主要内容19-21
第2章产羰基还原酶菌株的筛选与鉴定21-29
2.1 前言21
2.2 实验材料21-23
2.2.1 实验试剂与仪器21-22
2.2.2 土壤样品来源22
2.2.3 培养基22-23
2.3 实验方法23-25
2.3.1 菌株初筛与分离23
2.3.2 菌株复筛23-24
2.3.3 菌株鉴定24-25
2.4 结果与讨论25-27
2.4.1 菌株的初筛25
2.4.2 菌株的复筛25-26
2.4.3 菌株 40-116S rDNA鉴定结果26-27
2.4.4 系统进化树27
2.5 本章小结27-29
第3章类产碱假单胞菌XW-40菌株产酶条件的优化29-42
3.1 前言29
3.2 实验材料与仪器29-30
3.3 实验方法30-32
3.3.1 酶活力的测定30
3.3.2 类产碱假单胞菌XW-40产羰基还原酶的培养基优化30-31
3.3.3 类产假碱单胞菌XW-40产羰基还原酶的培养条件优化31-32
3.4 实验结果与讨论32-41
3.4.1 类产碱假单胞菌XW-40产羰基还原酶的培养基优化32-38
3.4.2 类产碱假单胞菌XW-40产羰基还原酶的培养条件优化38-41
3.5 本章小结41-42
第4章类产碱假单胞菌XW-40不对称还原制备(S)-1 转化条件的研究42-52
4.1 前言42
4.2 实验材料与仪器42
4.3 实验方法42-45
4.3.1 细胞培养与静息细胞制备42-43
4.3.2 HPLC条件43
4.3.3 催化反应条件的优化43-44
4.3.4 批次反应44
4.3.5 制备规模生物还原反应44-45
4.4 结果与讨论45-51
4.4.1 水溶性辅溶剂对反应的影响45-46
4.4.2 pH对反应的影响46
4.4.3 温度对反应的影响46-47
4.4.4 底物浓度对反应的影响47-48
4.4.5 细胞浓度对反应的影响48
4.4.6 辅底物对反应的影响48-50
4.4.7 催化还原2合成(S)-1 的时间历程的研究50
4.4.8 批次反应50-51
4.5 本章小结51-52
第5章树脂原位吸附与细胞包埋固定化的研究52-65
5.1 前言52-53
5.2 实验材料与仪器53-54
5.3 实验方法54-57
5.3.1 树脂原位吸附54-55
5.3.2 海藻酸钠包埋法固定化类产碱假单胞菌XW-40的研究55-57
5.4 结果与讨论57-63
5.4.1 树脂原位吸附57-60
5.4.2 海藻酸钠包埋法固定化类产碱假单胞菌XW-40细胞制备条件的优化60-63
5.5 本章小结63-65
第6章总结与展望65-67
6.1 总结65-66
6.2 展望66-67
参考文献67-73
附录A 部分HPLC图谱73-75
附录B 供试菌株 40-116S rDNA序列与Pseudomonas pseudoalcaligenes strain2-3(HQ285878.1)序列比对结果75-77
附录C 1H NMR与 13C NMR谱图77-78
致谢78-79
攻读硕士学位期间从事的科研工作及取得的成果79