新结构抗肿瘤先导化合物Rasfonin的结合蛋白研究

发布时间：2017-08-24 17:45

  本文关键词：新结构抗肿瘤先导化合物Rasfonin的结合蛋白研究

  更多相关文章： Rasfonin 活性小分子化合物 靶标研究 亲和层析 依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(DARTS)

【摘要】：活性小分子化合物,尤其是从植物、动物和海洋生物中分离获得的天然产物,因其生物学活性丰富多样,是新药发现中的重要来源。本实验室前期对一种来源于青藏高原海拔4千米以上的真菌Doratomyces sp.的次级代谢产物Rasfonin(由本研究所车永胜研究员课题组提供)进行了系统的药理学活性评价。研究发现,Rasfonin对ras基因突变的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,对K-ras突变的人源胰腺癌细胞Panc-1的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力均有显著的抑制作用。Rasfonin能够显著抑制CD1裸鼠Panc-1异体移植瘤的生长。对Rasfonin初步的信号通路研究表明,它能够通过下调Ras激活蛋白Sos1的表达来抑制Ras蛋白的活化,进而抑制Ras-MAPK下游蛋白激酶的磷酸化。研究还考察了Rasfonin对包括Ras信号通路在内的表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)信号通路相关的19种激酶活性的影响,结果表明,Rasfonin对其中大多数激酶活性均无明显影响,仅对mTOR下游p70S6K的活性有明显的上调作用。Rasfonin抗肿瘤作用确切,它能够通过下调Sos1蛋白的表达来抑制Ras蛋白的活化,进而影响其下游MAPK蛋白激酶的磷酸化,现有的Ras抑制剂中尚未见同类报道,Rasfonin有望成为抗肿瘤先导化合物,但其作用机制和靶标尚不明确。本研究对其在细胞内的结合蛋白进行了研究。新药研究中,常用的靶标方法可大致分为两类:从信号通路、组学数据等表型数据进行推导的正向方法和基于化合物与靶标亲和性结合的逆向方法。正向方法通过检测经小分子化合物处理后信号通路、基因表达、蛋白表达、代谢物等的改变,找出小分子化合物的潜在靶标;逆向方法则利用亲和原理,直接分离小分子化合物的结合蛋白,更为直接。亲和层析是利用化合物与靶蛋白的亲和性结合而进行靶标分离的经典的方法,通过将活性化合物固定于固相基质表面,“钓取”其结合蛋白。该方法成功案例较多,如免疫抑制剂FK506的结合蛋白FKBP12的发现、环孢菌素A的结合蛋白亲环蛋白的发现、非甾体抗炎药吲哚美辛的新结合蛋白乙二醛酶1(glyoxalase 1,GLO1)的发现等。尽管如此,小分子化合物溶解性差、与靶蛋白亲和力弱等因素常会限制经典亲和层析的使用,近些年其改良方法不断涌现。例如,针对高浓度的有机助溶试剂对体系产生的影响,Yamamoto等推出了系列亲和层析法。该方法不需要设置阴性对照和竞争性对照,是将蛋白样品连续与多个固定了小分子化合物的层析柱孵育,通过比较各层析柱留存蛋白的含量变化找出特异性的结合蛋白。针对经典亲和层析法中亲和能力较弱的结合蛋白容易在洗脱过程中流失的问题,可通过引进光亲和标签的方法,增强小分子化合物与靶蛋白的结合。应用亲和层析这类方法时由于需要将小分子化合物固定于固相载体表面,故通常需先对小分子化合物进行结构修饰,但结构修饰过程往往会改变其活性。2009年美国国家科学院院刊(proceedingsofthenationalacademyofsciences,pnas)报道了一种药物靶标辨识新技术——依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(drugaffinityresponsivetargetstability,darts)。该技术利用小分子化合物能够诱导结合蛋白构象形态趋于稳定、从而抵抗酶解作用的这一特性,从复杂的蛋白混合物中找到被小分子化合物保护的结合蛋白。darts也是基于药物-靶标的亲和性结合,但具有不需对化合物进行结构修饰的特点,甚至能够进行成分不明的复方药物的靶标研究,为小分子化合物结合蛋白的发现提供了崭新的思路和技术手段。现已有一些研究者应用darts成功获得了潜在靶标,例如,randall等发现,三羧酸循环的中间代谢产物α-酮戊二酸能够延长成年秀丽隐杆线虫的寿命,并运用darts发现了它在此作用中的新蛋白质靶标——atp合酶β亚基atp5b;molly等采用darts对葡萄籽提取物的作用靶点进行了初步探究,获得了grp78等十余种可能的结合蛋白,为其进一步靶标研究提供了线索等。本研究选择了两种能够直接分离结合蛋白的方法——传统的亲和层析法和新技术依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(darts),对rasfonin在细胞内的结合蛋白进行了探究,旨在获得rasfonin的结合蛋白,为其抗肿瘤作用靶标和机制研究提供有效线索。一、基于亲和层析法对抗肿瘤先导化合物rasfonin结合蛋白的研究1.rasfonin的生物素化修饰与活性检测由于亲和层析法要求小分子化合物能够被固定于固相基质,因此我们根据rasfonin的结构特点选择了生物素-亲和素系统作为连接媒介。本研究所车永胜研究员课题组对a304(rasfonin)及其阴性对照物a321进行了生物素化修饰。为了考察生物素化修饰是否改变了小分子的活性,我们采用cck8法检测了a304和a321及其生物素化衍生物a304-b、a321-b对k-ras基因突变的人胰腺癌细胞panc-1细胞增殖活性的影响。结果表明,a304对panc-1细胞增殖具有明显的抑制作用,ic50为9.07μm,与前期结果一致;a304-b的抑制趋势与a304一致,ic50为9.5μm;a321对panc-1细胞增殖的抑制作用不明显,ic50为19.3μm;但a321-b的ic50略有降低,为14.09μm。结果提示,a304修饰后活性未受到较大影响,可用于亲和层析实验;而a321修饰后活性略有增强,可能会影响后续实验。2.基于亲和层析法对rasfonin结合蛋白的搜寻2.1.应用经典亲和层析法对rasfonin结合蛋白的搜寻本研究首先采用链霉亲和素琼脂糖珠作为固相基质对rasfonin进行了经典亲和层析,联合聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page和考马斯亮蓝染色对各组琼脂糖珠结合的蛋白样品进行染色分析。为了排除非特异性结合蛋白的干扰,我们设置了阴性对照组和小分子竞争性对照组。实验结果表明,与溶剂对照组和竞争对照组相比,a304-b和a321-b处理组在分子量40~70kda之间均可见三条差异条带。由于琼脂糖珠的孔径较大,约45~165μm,容易吸附和潴留非特异性结合蛋白,导致背景较高,影响对结果的观察;因此,本研究还选择直径仅2.8μm且颗粒均匀的磁珠为固相基质进行了rasfonin结合蛋白的搜寻,在相似的分子量范围内也观察到了五条差异条带。在经典亲和层析中,阴性对照组的作用并不明显,可能与阴性对照物活性增强有关。为了弥补这一不足,同时也为了降低助溶有机试剂dmso对体系的干扰,我们还采用改良方法系列亲和层析进行了rasfonin结合蛋白的搜寻。实验中将蛋白样品连续与两个固定有a304-b的层析柱反应(依次编号a304-b-1和a304-b-2)。结果发现,a304-b-1组与溶剂对照组和a304-b-2组相比,在35~70kda分子量范围内出现了四条明显的差异条带。除35kda的一组外,其余各组差异条带的分子量范围均与经典亲和层析法条带位置相似。2.2.亲和层析法所得差异蛋白的质谱鉴定与分析综合分析两种亲和层析法的实验结果,我们选择了35~70kda范围内分子量一致且有明显差异的五组条带(rasfonin处理组的差异条带与相应位置处溶剂对照组的蛋白条带为一组),采用纳升液相电喷雾串联质谱nanolc进行了检测,并将蛋白的质谱数据在ncbi-nrgreenplants数据库中进行了mascot检索。检索结果的匹配程度用得分值来体现,得分值越大匹配度越高,一般得分值高于200即表示检索结果匹配良好,但当得分值低于200时,若含有至少两条较确定的特异性片段,也可认为该检测结果可信。以此为依据,我们对检测结果进行了分析,排除了匹配度较低以及在溶剂对照组中也出现的蛋白,发现了30种差异蛋白(即rasfonin处理组中包含但溶剂对照组中不包含的蛋白)。对这些差异蛋白与肿瘤的相关性进行文献调研,我们发现dx39a、rbbp7等10种蛋白与肿瘤或相关信号通路存在密切联系,可作为rasfonin结合蛋白深入研究的线索。二、基于依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(drugaffinityresponsivetargetstability,darts)对抗肿瘤先导化合物rasfonin结合蛋白的研究1.darts的概念验证darts利用小分子配体能够使结合蛋白构象形态更稳定这一特性,通过观察经小分子和蛋白酶处理后蛋白样品中受到小分子保护的蛋白含量变化,找出小分子的结合蛋白。为了验证darts原理的可行性,本研究参照文献,选取经darts验证成功的雷帕霉素及其高亲和力靶蛋白fkbp12进行了实验。sds-page和westernblotting检测分析结果表明,在文献所述条件下,与溶剂对照组相比,添加雷帕霉素的酶解组中fkbp12人源重组蛋白的水解程度明显降低,条带显色增强,说明雷帕霉素确实能从一定程度上保护fkbp12免受蛋白酶水解。2.darts实验条件摸索现已有多个研究小组应用darts获得了小分子化合物的靶标或相关信息,但darts的具体实验条件仍有待于进一步探索和优化。本研究对darts中不同蛋白酶酶解能力、蛋白酶浓度和酶解时长等关键实验条件进行了初步摸索。2.1.不同种类蛋白酶酶解能力的比较我们根据文献选择了三种darts常用的广谱蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、链霉蛋白酶),对其酶解能力进行了比较。对工具细胞人源急性t淋巴细胞白血病细胞jurkat非变性裂解提取的总蛋白室温酶解15min,每种蛋白酶的浓度均由高到低设置(酶与蛋白质量比)1:500、1:1000、1:2500、1:5000和1:10000五个梯度。结果表明,枯草杆菌蛋白酶作用剧烈,浓度1:500便几乎将蛋白全部水解;嗜热菌蛋白酶作用极弱,浓度1:500时仅可水解总蛋白的10%~20%;链霉蛋白酶作用相对柔和,在1:500~1:5000范围内约可水解总蛋白的30~60%。此结果与文献报道一致,提示链霉蛋白酶1:500~1:5000的浓度范围较适合darts。2.2.不同浓度蛋白酶对darts结果的影响结合上述实验所得结果和文献推荐条件,我们选择作用较温和的链霉蛋白酶,以成功应用darts找到新靶标的α-酮戊二酸为研究对象进行了总蛋白水平的实验,考察在相同酶解温度、相同酶解时长条件下,不同浓度链霉蛋白酶(1:500,1:1000,1:2500和1:5000)对darts结果的影响。结果表明,对于α-酮戊二酸,链霉蛋白酶浓度1:1000的条件下可观察到的含量存在差异的蛋白条带数目最多,差异条带所在位置同原文献结果基本一致;其它酶浓度条件下,由于酶解作用过弱或过强,差异条带的呈现效果均受到影响。结果提示,链霉蛋白酶浓度1:1000较适合darts中结合蛋白的显现。2.3.不同酶解时长对darts结果的影响在获得了α-酮戊二酸darts最佳酶浓度(链霉蛋白酶浓度1:1000)的基础上,本研究考察了不同酶解时长(5、15、30min)对α-酮戊二酸darts结果的影响。结果表明,该酶浓度条件下,酶解5min明显不足,并未观察到差异条带;酶解15min时,可观察到的5个差异条带,数目最多;酶解30min时仅能观察到一个不明显的差异条带。该结果提示,在链霉蛋白酶浓度为1:1000的条件下,酶解15min较适合darts结合蛋白的显现。2.4.darts优化酶解条件的简单验证为了验证优化所得酶解条件(链霉蛋白酶1:1000、酶解15min)的可行性,我们选取靶标已知、但未用darts验证过的小分子免疫抑制剂霉酚酸为研究对象,从人源重组蛋白和总蛋白两个水平进行了考察。人源重组蛋白水平darts结果表明,在链霉蛋白酶浓度1:1000、作用5min的条件下(由于人源重组蛋白纯度较高,不存在无关蛋白的干扰,因此将酶解时间缩短至5min),与溶剂对照组相比,霉酚酸处理组的impdh1人源重组蛋白条带被水解的程度减弱,显色明显增强,表明霉酚酸确实能保护其靶蛋白抵抗酶解。全蛋白水平darts结果表明,在链霉蛋白酶浓度1:1000、作用15min的条件下,可观察到55~70kda范围内有三条明显的差异条带。经westernblotting检测,分子量55kda处呈现含量变化的差异条带中包含impdh1。结果提示,前期实验优化所得酶解条件(链霉蛋白酶1:1000、酶解15min)可操作性较强,可作为rasfonin的darts研究的起步条件。3.基于darts对rasfonin结合蛋白的搜寻3.1.应用darts对rasfonin结合蛋白的搜寻参考前期优化的darts条件,我们采用链霉蛋白酶1:1000的酶浓度,酶解时长5~30min,以工具细胞jurkat总蛋白为蛋白原料,对rasfonin进行了darts总蛋白水平实验。结果表明,与dmso溶剂对照组相比,rasfonin10和100μm处理组在酶解5min和15min时,能够明显观察到在40~55kda分子量范围内有两组较为明显的差异条带。将细胞更换为k-ras基因突变的人源胰腺癌细胞panc-1进行实验,得到了一致的结果。与亲和层析实验结果对比发现,差异条带所出现的分子量范围较一致,提示结合蛋白在40~55 kDa范围内的可能性较大。3.2.DARTS所得差异蛋白的质谱鉴定与分析运用上述亲和层析差异条带的鉴定分析方法,我们对这两组差异条带进行了质谱鉴定和Mascot分析。通过初步筛选,排除了匹配度较低以及在溶剂对照组中也出现的蛋白,共获得了12种可信的差异蛋白。通过进一步文献调研,我们发现其中YBOX1、AMPL、XPO2(CSE1L)等11种蛋白有与肿瘤相关的研究,可作为Rasfonin结合蛋白深入研究的线索。对于亲和层析和DARTS所获得的共21种可能的结合蛋白,进一步的亲和力筛选和功能验证工作仍在进行中。结论通过研究,本论文得到以下结论:1.本课题建立了Rasfonin结合蛋白的研究技术平台,包括传统的亲和层析法和靶标发现新技术DARTS两个实验体系,并对新技术DARTS的实验条件进行了优化;2.应用亲和层析法对Rasfonin进行了结合蛋白的搜寻,共发现了30种差异蛋白,并通过对蛋白相关文献的调研发现其中有10种蛋白与肿瘤或相关信号通路存在密切联系,可作为Rasfonin结合蛋白深入研究的线索;3.应用DARTS对Rasfonin进行了结合蛋白的搜寻,共发现了12种差异蛋白,并通过对蛋白相关文献的调研发现其中有11种蛋白与肿瘤或相关信号通路存在密切联系,可作为Rasfonin结合蛋白深入研究的线索。综上所述,本课题首次应用传统的亲和层析法和靶标研究新技术DARTS对抗肿瘤先导化合物Rasfonin进行了结合蛋白的搜寻,共获得了21种结合蛋白候选目标,为进一步确定其抗肿瘤靶标提供了重要线索。进一步筛选和验证工作仍在进行中。
【关键词】：Rasfonin 活性小分子化合物 靶标研究 亲和层析 依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(DARTS)
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 中文摘要8-14
• Abstract14-22
• 前言22-24
• 材料与方法24-38
• 一、实验材料24-30
• 二、实验方法30-37
• 三、统计学处理37-38
• 实验结果38-58
• 一、基于亲和层析法对抗肿瘤先导化合物Rasfonin结合蛋白的研究38-46
• 1 Rasfonin的生物素化修饰与活性检测38-39
• 1.1 Rasfonin的生物素化修饰38
• 1.2 衍生化合物的活性测定38-39
• 2 基于亲和层析法对Rasfonin结合蛋白的搜寻39-46
• 2.1 应用经典亲和层析法对Rasfonin结合蛋白的搜寻39-41
• 2.2 应用系列亲和层析法对Rasfonin结合蛋白的搜寻41-42
• 2.3 亲和层析法所得差异蛋白的质谱鉴定与分析42-46
• 二、基于依赖于靶点稳定性的药物亲和反应（Drug Affinity Responsive TargetStability, DARTS）对抗肿瘤先导化合物Rasfonin结合蛋白的研究46-58
• 1 DARTS的概念验证47-48
• 2 DARTS实验条件摸索48-53
• 2.1 不同种类蛋白酶酶解能力的比较48-49
• 2.2 不同浓度蛋白酶对DARTS结果的影响49-51
• 2.3 不同酶解时长对DARTS结果的影响51
• 2.4 DARTS优化酶解条件的验证51-53
• 3 基于DARTS对Rasfonin结合蛋白的研究53-58
• 3.1 应用DARTS对Rasfonin结合蛋白的搜寻53-54
• 3.2 DARTS所得差异蛋白的质谱鉴定与分析54-58
• 讨论58-69
• 结论69-70
• 参考文献70-81
• 个人简历81-82
• 致谢82-83

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