蚊miR-278-3p与抗药性关系的研究

发布时间：2017-08-26 06:27

  本文关键词：蚊miR-278-3p与抗药性关系的研究

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【摘要】：蚊媒病是一类危害人类健康的重要传染病,包括疟疾、登革热、西尼罗河热、丝虫病、日本脑炎等。化学防治因其长效、方便等特性,始终是蚊媒控制策略中的重要手段。但随着杀虫剂的大规模使用,蚊抗药性也随之产生并不断发展,进一步加剧蚊媒病传播的态势。WHO预言,抗药性将成为蚊媒病防治中的一大障碍。因此,蚊媒抗药性的机制研究及新的抗药性基因的发现仍是蚊媒病防治的重点。代谢抗性是蚊媒抗药性的主要机制。长期以来,代谢抗性主要关注杀虫剂代谢相关酶类表达水平的变化。miRNA是一类重要的转录后调控因子,通过与mRNA结合调节体内基因的表达水平。目前,基因转录后的miRNA调控机制集中于昆虫miRNA测序及感染免疫等方面;抗药性相关miRNA的研究尚未见报道。本实验室前期采取solexa测序法发现miR-278-3p在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中低表达。在此基础上,本研究首先预测其靶基因,通过qPCR检测其表达水平,并通过双荧光素酶报告系统进一步验证miR-278-3p与CYP6AG11的调控关系;然后,通过转染后高表达、干涉后低表达等方法,研究CYP6AG11对蚊细胞及蚊溴氰菊酯敏感性的影响;最后,通过基因注射miR-278-3p到成蚊体内,研究miR-278-3p对蚊溴氰菊酯敏感性的影响,同时通过qPCR检测CYP6AG11的表达水平。主要研究结果如下:1.靶标预测提示,miR-278-3p的种子序列可与CYP6AG11的3’UTR序列完全互补配对;qPCR结果显示,miR-278-3p在淡色库蚊敏感品系高表达,而CYP6AG11在抗性品系高表达,提示miR-278-3p可能调节CYP6AG11的表达。双荧光素酶报告检测显示,加入miR-278-3p mimic组可使荧光读值降低,进一步证实miR-278-3p可在细胞内调节CYP6AG11的表达。2.构建淡色库蚊CYP6AG11表达载体并转染入C6/36细胞,CCK8检测显示,经不同浓度溴氰菊酯处理后,CYP6AG11转染组的存活率高于对照组,即高表达CYP6AG11后蚊细胞对溴氰菊酯敏感性降低。同时,将干扰RNA(siRNA)注射入成蚊体内后,CDC bottle检测结果显示,干扰组的死亡率高于对照组,即干扰CYP6AG11的表达后蚊对溴氰菊酯敏感性提高。表明CYP6AG11参与溴氰菊酯抗性的形成,是一个新的抗药性相关基因。3.将miR-278-3p mimic注射入成蚊体内,qPCR检测显示,mimic组CYP6AG11的表达明显低于对照组,提示miR-278-3p可以在成蚊体内调节CYP6AG11的表达;CDC bottle检测结果显示,接触溴氰菊酯后,miR-278-3p mimic注射组的死亡率高于对照组。实验结果进一步验证,miR-278-3p可通过调节CYP6AG11参与抗药性的形成。4.qPCR检测不同现场敏感及抗性品系中CYP6AG11与miR-278-3p的表达差异,结果显示,miR-278-3p在平阴及商河现场敏感品系中呈高表达,差异倍数分别为1.7和2.1;CYP6AG11在平阴及商河现场抗性品系中呈高表达,差异倍数分别为21.3和2.0,但是其差异无统计学意义(P0.05),需扩大现场样本量进一步检测。本研究报告了淡色库蚊miR-278-3p通过调节CYP6AG11的表达,参与抗药性的形成,研究结果为阐明抗药性分子机制提供了新的科学依据。
【关键词】：淡色库蚊 溴氰菊酯 抗药性 miR-278-3p CYP6AG11
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-41
• 一、实验材料12-15
• （一）供试蚊12
• （二）细胞系12
• （三）主要试剂12-13
• （四）主要溶液配方13-14
• （五）主要仪器14-15
• 二、实验方法15-41
• （一）淡色库蚊mi R2783p与CYP6AG11的关系15-29
• （二）淡色库蚊CYP6AG11与抗药性的关系29-39
• （三）蚊mi R2783p、CYP6AG11与抗药性的关系39-40
• （四）蚊现场品系中mi R2783p与CYP6AG11的表达水平40-41
• 结果41-54
• 一、淡色库蚊mi R2783p与CYP6AG11的关系41-47
• 二、淡色库蚊CYP6AG11与抗药性的关系47-51
• 三、蚊mi R2783p、CYP6AG11与抗药性的关系51-52
• 四、蚊现场品系中mi R2783p与CYP6AG11的表达水平52-54
• 讨论54-59
• 小结59-60
• 参考文献60-69
• 综述69-82
• 参考文献75-82
• 已发表文章82-83
• 致谢83

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1 雷震涛;蚊miR-278-3p与抗药性关系的研究[D];南京医科大学;2015年

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本文编号：740212