青蒿素衍生物蒿甲醚抗癌机理的研究

发布时间：2017-09-02 06:47

  本文关键词：青蒿素衍生物蒿甲醚抗癌机理的研究

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【摘要】：目的：蒿甲醚(Artemether)为青蒿素的脂溶性衍生物,在临床上治疗恶性疟和脑型疟有显著疗效。近年的研究发现,青蒿素及其衍生物有明确的抗肿瘤和抑制肿瘤血管生成的作用。本项研究根据青蒿素及其衍生物所具有的抗肿瘤和抑制肿瘤血管生成作用,及其能透过血脑屏障进入脑组织的药代动力学特性,研究蒿甲醚作用于人脑胶质瘤体内及体外的作用效果,为胶质瘤的治疗提供一种新的思路和手段。方法：体外培养人脑胶质瘤细胞株U251,药物蒿甲醚作用后分为两组：蒿甲醚组和对照组。四甲基偶氮做盐(MTT)法分别检测各组细胞增殖和抑制情况；使用Trans-well法检测两组细胞的侵袭及迁移能力；使用透射电镜和流式细胞仪对两组细胞的凋亡情况进行定性和定量检测；通过蛋白质印迹法对两组细胞中靶基因(Bcl-2,VEGF和MMP-2,MMP-9,MMP-4,APl5及c-MET)蛋白的表达量进行检测。建立小鼠皮下模型,对小鼠进行分组：蒿甲醚组,顺铂组及阴性对照组。采用灌胃给药法持续给药。观察各组小鼠生存状态,记录小鼠体重及肿瘤体积,计算抑瘤率并绘制曲线,比较各组小鼠的抑瘤情况。肿瘤组织进行苏木精-伊红染色(HE染色)和免疫组织化学染色,比较各组小鼠肿瘤生长状况和血管内皮生成在肿瘤细胞的表达状况。结果：1,蒿甲醚能够抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖并且呈剂量和时间的作用关系(P0.05)。蒿甲醚组及对照组相比,蒿甲醚组细胞的生长、增殖、迁移及侵袭等能力得到了明显的抑制,而细胞的凋亡比率增加,并发生了细胞Go/G1期阻滞,统计学差异显著(P0.05)。2,小鼠皮下模型建立结果,蒿甲醚最适剂量组的小鼠状态比较良好,高剂量组小鼠状态比较低糜,阴性对照组的小鼠表现出不活跃状态,从肿瘤体积和大小看,高剂量组的和最适剂量组的差别不大,两组的肿瘤体积和大小都比阴性对照组小,差异显著(P0.05),但高剂量对小鼠的状态有影响。3,HE染色结果显示阴性对照组的脑胶质瘤细胞密集成群,呈短梭或不规则形,向脑组织呈浸润性生长,其肿瘤细胞密集程度明显高于其它各实验组。从免疫组化染色结果可见,阴性对照组的血管密度要高于其他实验组。结论：蒿甲醚能够降低靶基因VEGF,MMP-2, MMP-4,MMP-9, c-MET,API5及Bcl-2的表达和抑制肿瘤细胞的增殖、转移及迁移,参与脑胶质瘤细胞凋亡的调控机制。蒿甲醚能够抑制肿瘤细胞增殖,转移的机制是透过血脑屏障抑制血管的生成,这为蒿甲醚的临床抗癌药物开发提供了依据,也从另一个层面显示了青蒿素及其衍生物不仅有抗疟活性,还具有广谱的抗癌效果。
【关键词】：蒿甲醚 U251人脑胶质瘤细胞 动物模型 靶基因
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-16
• 1. 青蒿素及其衍生物11-12
• 2. 青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用机制12-13
• 2.1 青蒿素化合物与铁的氧化应激反应12
• 2.2 诱导细胞凋亡和周期阻滞12-13
• 2.3 抗肿瘤新生血管的生成13
• 3. 脑胶质瘤13-14
• 4. 脑胶质瘤的临床药物14
• 5. 本研究的目的及意义14-16
• 第二章 材料和方法16-29
• 1. 材料16-17
• 1.1 细胞株16
• 1.2 主要试剂16-17
• 2. 方法17-29
• 2.1 脑胶质瘤细胞的培养17-18
• 2.1.1 细胞的复苏17
• 2.1.2 细胞的传代17
• 2.1.3 细胞的冻存17-18
• 2.2 细胞半数抑制率的计算18-20
• 2.2.1 细胞计数及种板18
• 2.2.2 细胞药物实验18-19
• 2.2.3 96孔板读数19
• 2.2.4 计算半数抑制率(IC_(50))19-20
• 2.3 蒿甲醚与胶质瘤细胞中相应靶基因的表达调控(Western bloting)20-24
• 2.3.1 细胞药物处理20
• 2.3.2 单层贴壁细胞总蛋白提取20-21
• 2.3.4 BCA法蛋白定量21
• 2.3.5 SDS-PAGE凝胶的配制21-22
• 2.3.6 SDS-PAGE电泳22-23
• 2.3.7 转膜(湿转法)23
• 2.3.8 免疫反应23
• 2.3.9 化学发光、显影及定影23-24
• 2.4 四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测U251细胞的生长及增殖状况24
• 2.4.1 细胞种板(96孔板)24
• 2.4.2 细胞抑制率的计算24
• 2.5 细胞迁移实验(划痕实验)24-25
• 2.6 细胞侵袭实验(Trans-well试验)25
• 2.7 流式细胞术检测细胞凋亡25
• 2.8 透射电镜分析凋亡细胞形态25
• 2.9 皮下移植瘤模型建立25-29
• 2.9.1 BALBc裸鼠皮下移植瘤模型建立(预实验)25-26
• 2.9.2 BALBc裸鼠皮下移植瘤模型建立26
• 2.9.3 裸鼠脑胶质瘤肿瘤体积测定及HE染色和免疫组化测定26-29
• 第三章 结果29-40
• 1. 蒿甲醚药物实验29
• 2. 蒿甲醚药物处理后各组细胞的生长状况29-31
• 3. 各组细胞的增殖情况31
• 4. 各组细胞迁移能力的比较31-32
• 5. 各组细胞侵袭能力的比较32-33
• 6. 各组细胞的凋亡情况33-35
• 7. 各组细胞靶基因蛋白的表达情况35-37
• 8. 老鼠皮下模型建立结果分析37-40
• 8.1 大鼠生存状态的观察37
• 8.2 蒿甲醚预实验抑瘤结果分析37
• 8.3 皮下移植瘤抑瘤结果分析37-38
• 8.4 HE染色及免疫组化结果分析38-40
• 第四章 结论与讨论40-45
• 1. 实验结论40
• 2. 讨论及展望40-45
• 附录Ⅰ：实验材料45-48
• 表1 主要试剂用品45-46
• 表2 实验仪器设备46-47
• 表3 实验耗材47-48
• 附录Ⅲ：实验数据处理48
• 附录Ⅳ：英文缩写词表48-49
• 附录Ⅴ：综述49-63
• References58-63
• 参考文献63-72
• 攻读硕士学位期间完成的科研成果72-73
• 致谢73

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1 姚俊敏,蔡s，

本文编号：777016