NO供体型桦木醇衍生物的合成及抗肿瘤机制的研究

发布时间：2017-09-13 11:30

  本文关键词：NO供体型桦木醇衍生物的合成及抗肿瘤机制的研究

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【摘要】：目的：桦木醇(Betulin, BT),一种重要的羽扇豆烷型三萜化合物,具有抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗炎等广泛的药理活性。但BT存在着水溶性低、药效不显著等问题,限制了其在临床上的应用。因此,为了获得具有良好抗肿瘤活性的BT衍生物,本研究对系列桦木醇NO供体衍生物进行了合成,并研究了各衍生物体外NO释放,选择人肝癌细胞株Huh7和乳腺癌细胞株MCF-7评价化合物的增殖抑制作用,对潜在抗肿瘤作用衍生物的凋亡机制进行探讨。方法：采用酯化、亲核取代、自由基取代等对BT的C-3、C-28或／和C-30进行了修饰；Griess法测定了各衍生物体外NO释放；MTT法及细胞克隆形成实验评价了桦木醇NO供体衍生物对肿瘤细胞的增殖抑制活性；Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率；流式细胞技术检测了桦木醇NO供体衍生物对细胞周期的影响及对线粒体膜电位的影响；免疫印迹技术检测了对细胞周期蛋白(CDK1、CDC25C和CyclinB1)的表达影响,对凋亡相关蛋白(Caspase 3、Caspase 9和PARP)的剪切情况；对线粒体调控蛋白(Bcl-2、Bax)及细胞色素c(Cyt c)释放的作用；对PI3K/Akt信号通路表达改变的影响。结果：研究共合成7个NO供体的BT衍生物：3,28-二-[4-(2-硝氧基乙氧基)-1,4-丁二酰]-氧基桦木醇、3,28-二-[4-(4-硝氧基丁氧基)-1,4-顺丁烯二酰]-氧基桦木醇、3,28-二-乙酰氧基-30-硝氧基-桦木醇、3,28-二-{4-(8-硝氧-2,6-二氧二环[3.3.0]辛烷-4-氧)甲酰-苯甲酰氧基}-桦木醇、3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇、3,28-二-(2-硝氧基-丙酰氧基)-桦木醇、3,28-二-(2-硝氧基-异丁酰氧基)-桦木醇。所有的化合物均经红外光谱、核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)等技术手段鉴定。各个BT衍生物的NO释放情况各不相同,大多数衍生物的NO释放量随时间的变化改变不大,可较快达到平衡状态。其中,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰基)-氧基桦木醇具有良好的抗肿瘤活性,并成功抑制Huh7、MCF-7肿瘤细胞生长,呈剂量依赖性。Annexin V-FITC/PI双染法证实3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇诱导Huh7细胞凋亡,通过调控Caspase家族蛋白通路来实现。其中Caspase 3与Caspase 9表达减少,而C-Caspase 3和C-Caspase 9表达明显增加。此外,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇可使Huh7细胞阻滞于G2/M周期。JC-1检测到线粒体跨膜电位的损失,且JC-1单体的绿色荧光表达从3.48%增加到23.4%,说明了化合物是通过线粒体途径诱导细胞凋亡,并影响线粒体调控蛋白的表达。研究中发现Bcl-2蛋白表达水平下降,而Bax表达水平增加,Cyt c从线粒体中大量释放。Western Blotting结果显示,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇呈剂量依赖性地显著降低了P13K催化亚基p110α, AKT及p-AKT的水平。结论：3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇具有比桦木醇更强的抗肝癌活性,通过抑制PI3K/AKT通路,下调Bcl-2蛋白表达、降低线粒体膜电位以及促进Cyt c的释放,触发Huh7细胞凋亡。因此,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇作为一个具有潜在抗肝癌试剂,值得进一步的研究。
【关键词】：桦木醇衍生物 合成 NO释放 抗肿瘤 细胞凋亡
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914.5;R96
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 引言9-10
• 第一章 文献综述10-21
• 1 细胞凋亡10-11
• 1.1 PI3K/Akt通路10
• 1.2 线粒体通路10-11
• 2 桦木醇及其衍生物抗肿瘤作用的研究11-18
• 2.1 BT体外抗肿瘤作用11
• 2.2 BT体内抗肿瘤作用11-12
• 2.3 增加BT水溶性12-13
• 2.4 提高BT生物活性13-18
• 3 NO供体药物的研究18-19
• 4 研究目的与意义19-21
• 第二章 NO供体型桦木醇衍生物的合成21-35
• 1 仪器与试剂21
• 1.1 仪器21
• 1.2 主要试剂21
• 2 3,28-二-[4-(2-硝氧基-乙氧基)-1,4-丁二酰基]-氧基桦木醇的合成21-23
• 2.1 合成路线22
• 2.2 3,28-二-(4-羧基-丁酰基)-氧基桦木醇(1)的合成22
• 2.3 3,28-二-[4-(2-溴基-乙氧基)-1,4-丁二酰基]-氧基桦木醇(2)的合成22-23
• 2.4 3,28-二-[4-(2-硝氧基-乙氧基)-1,4-丁二酰基]-氧基桦木醇(3)的合成23
• 3 3,28-二-[4-(4-硝氧基-丁氧基)-1,4-顺丁烯二酰]-氧基桦木醇的设计合成23-25
• 3.1 合成路线24
• 3.2 3,28-二-(4-羧基-丁烯酰基)-氧基桦木醇(1)的合成24
• 3.3 3,28-二-[4-(4-溴-丁氧基)-1,4-顺丁烯二酰]-氧基桦木醇(2)的合成24-25
• 3.4 3,28-二-[4-(4-硝氧基-丁氧基)-1,4-顺丁烯二酰]-氧基桦木醇(3)的合成25
• 4 3,28-二-乙酰氧基-30-硝氧基-桦木醇的设计合成25-26
• 4.1 合成路线25-26
• 4.2 3,28-二乙酰氧基-桦木醇(1)的合成26
• 4.3 3,28-二乙酰氧基-30-溴-桦木醇(2)的合成26
• 4.4 3,28-二乙酰氧基-30-硝氧基-桦木醇(3)的合成26
• 5 3,28-二-{4-(8-硝氧-2,6-二氧二环[3.3.0]辛烷-4-氧)甲酰-苯甲酰氧基｝的设计合成26-28
• 5.1 合成路线27
• 5.2 3,28-二-(4-氯甲酰基-苯甲酰氧基)-桦木醇(1)的合成27
• 5.3 3,28-二-｛4-(8-硝氧-2,6-二氧二环[3.3.0]辛烷-4-氧)甲酰-苯甲酰氧基}(2)的合成27-28
• 6 3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇的设计合成28-29
• 6.1 合成路线28
• 6.2 3,28-二-(2-溴-乙酰氧基)-桦木醇(1)的合成28-29
• 6.3 3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-桦木醇(2)的合成29
• 7 3,28-二-(2-硝氧基-丙酰氧基)-桦木醇的设计合成29-30
• 7.1 合成路线29
• 7.2 3,28-二-(2-溴-丙酰氧基)-桦木醇(1)的合成29-30
• 7.3 3,28-二-(2-硝氧基-丙酰氧基)-桦木醇(2)的合成30
• 8 3,28-二-(2-硝氧基-异丁酰氧基)-桦木醇的设计合成30-31
• 8.1 3,28-二-(2-硝氧基-异丁酰氧基)-桦木醇的合成路线30
• 8.2 3,28-二-(2-溴-异丁酰氧基)-桦木醇(1)的合成30-31
• 8.3 3,28-二-(2-硝氧基-异丁酰氧基)-桦木醇(2)的合成31
• 9 讨论31-35
• 9.1 合成条件探索31-32
• 9.2 结构解析32-35
• 第三章 桦木醇衍生物的体外NO释放测定35-39
• 1 Griess方法测定体外NO释放原理35
• 2 仪器与试剂35
• 2.1 仪器35
• 2.2 试剂、规格及产地35
• 3 溶液的配制35-36
• 3.1 0.1mol/L的NaOH的配制35
• 3.2 L-半胱甘酸磷酸缓冲液的配制35
• 3.3 Griess溶液的配制35-36
• 3.4 标准储备液的配制36
• 3.5 标准工作溶液的配制36
• 3.6 受试品(NO供体型桦木醇衍生物)溶液的配制36
• 4 标准曲线的绘制36-37
• 5 桦木醇类衍生物体外NO释放量的测定37
• 6 讨论37-39
• 第四章 NO供体型桦木醇衍生物在肝癌细胞Huh7和乳腺癌细胞MCF-7的体外抗肿瘤活性筛选39-45
• 1 实验原理39
• 2 仪器、试剂及细胞株39-40
• 2.1 仪器39
• 2.2 试剂与细胞株39-40
• 3 溶液的配制40
• 4 细胞培养及处理40-41
• 5 MTT实验41
• 6 各NO供体型桦木醇衍生物抗肿瘤活性比较41-43
• 7 讨论43-45
• 第五章 3,28-二-[(2-硝氧基)-乙酰氧基]-桦醇诱导肝癌细胞Huh7凋亡活性的研究45-55
• 1 仪器、试剂与细胞株45-46
• 1.1 仪器45
• 1.2 试剂与细胞株45-46
• 2 溶液的配制46-47
• 3 实验方法47-48
• 3.1 细胞增殖抑制试验47
• 3.2 DNA含量分析47
• 3.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率47
• 3.4 线粒体膜电位检测47
• 3.5 免疫印迹分析(Western Blotting)47-48
• 3.6 统计学处理48
• 4 实验结果48-53
• 4.1 细胞克隆形成实验48-49
• 4.2 DNA含量分析49
• 4.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率49-50
• 4.4 线粒体膜电位检测50-51
• 4.5 免疫印迹分析(Western Blotting)51-53
• 5 讨论53-55
• 第六章 结语55-56
• 1 研究结果55
• 2 研究特色与创新55
• 3 展望55-56
• 参考文献56-62
• 附录62-76
• 在校期间发表论文、项目资助及奖励情况76-77
• 致谢77-78
• 附件1:统计学处理合格证明统计学审核证明78

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本文编号：843447