产碱假单胞菌降解地塞米松相关蛋白酶的研究

发布时间：2017-09-15 12:00

  本文关键词：产碱假单胞菌降解地塞米松相关蛋白酶的研究

  更多相关文章： 产碱假单胞菌 驯化 地塞米松 蛋白质 降解酶 特性

【摘要】：目的：本文在从医院废水中分离到一株可降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌的基础上,进一步分离提取与该菌降解有关的蛋白酶,并探讨其特性,为制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂奠定基础。方法：将分离的降解地塞米松的产碱假单胞菌在地塞米松磷酸钠培养液长期反复培养训化,以提高该菌对地塞米松的降解率。再用渗透休克法提取该菌的胞外蛋白、周质蛋白和胞内蛋白,SDS-PAGE电泳分析提取的各部位蛋白,对主要蛋白进行质谱鉴定。用高效液相色谱法(HPLC)检测各部位蛋白的降解酶活性,以确定降解酶存在的部位。对具有酶活性的胞内蛋白先用硫酸铵盐析,再用离子交换层析与葡聚糖凝胶层析相结合的方法进一步提取纯化。用]HPLC法检测在纯化过程中蛋白酶的降解活性,用BCA法检测蛋白浓度,再计算出比活力,纯化倍数及回收率。将纯化后的蛋白酶切后质谱鉴定,并测定其降解反应的动力学特征。结果：地塞米松降解菌经多次驯化后,对地塞米松磷酸钠的降解率从驯化前的50.89%提高到75.7%,将地塞米松降解为其它物质的降解率从23.63%提高到74.99%。驯化菌在驯化前后对地塞米松磷酸钠与地塞米松的降解有显著的统计学差异(P0.05)。在常规培养条件下对地塞米松磷酸钠与地塞米松也有显著的降解作用。从驯化菌提取到分子量约为100kDa,41kDa及20kDa三种主要蛋白质,质谱鉴定分别与TonB依赖性受体蛋白,异戊酰辅酶A脱氢酶和假定蛋白有较高的相似性。驯化菌的胞内蛋白具有较高的降解酶活性。从胞内蛋白中提取纯化到41kDa蛋白,质谱鉴定与异戊酰辅酶A脱氢酶有较高的相似性。降解酶在温度25℃-40℃和pH6.5-pH8.5条件下具有较好的降解作用,酶促反应动力学方程为Ct-C0 e-0.1769t,符合一级动力学方程。结论：本文成功驯化了所分离的地塞米松降解菌,明确了降解酶所存在的部位。成功提取了驯化菌的主要蛋白,明确了这些蛋白的性质。提取纯化了胞内蛋白中的降解酶,了解了酶蛋白的降解特性,构建了酶促反应动力学方程。为进一步制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂提供了实验材料和理论基础。
【关键词】：产碱假单胞菌 驯化 地塞米松 蛋白质 降解酶 特性
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 第一部分 地塞米松降解菌的驯化和降解特性13-23
• 1 材料与方法13-17
• 2 结果17-22
• 3 讨论22-23
• 第二部分 驯化菌主要蛋白的提取23-34
• 1 材料与方法23-26
• 2 结果26-32
• 3 讨论32-34
• 第三部分 地塞米松降解酶的纯化鉴定及特性34-48
• 1 材料与方法34-38
• 2 结果38-45
• 3 讨论45-48
• 全文总结48-50
• 参考文献50-54
• 文献综述54-64
• 参考文献60-64
• 致谢64-65
• 攻读学位期间的研究成果65

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本文编号：856384