胞内微环境触发pH氧化还原双敏感释药PAMAM靶向递药系统的研究

发布时间：2017-09-18 17:20

  本文关键词：胞内微环境触发pH氧化还原双敏感释药PAMAM靶向递药系统的研究

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【摘要】：目的:本研究旨在构建集长循环、主动靶向、pH氧化还原双敏感、溶酶体逃逸等多功能于一体的高效、智能抗肿瘤递药系统,以期实现抗肿瘤药物在肿瘤靶细胞内的有效递送及快速释放。同时,对所制备的复合物递药系统的体内外抗肿瘤效果及机制进行考察与探讨。方法:首先,以4代的聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)为聚合物骨架材料,通过酰胺反应在其表面引入组氨酸(His),并控制PAMAM和His的反应投料比(1:8、1:16和1:32),合成三种不同His修饰程度的PAMAM-His(PH)载体;采用物理包埋的方式将抗肿瘤模型药物阿霉素(DOX)包载在PAMAM-His的疏水空腔内制备一系列载药复合物,通过体外释放、细胞毒性和细胞摄取实验等筛选最佳的His和PAMAM投料比。然后,聚乙二醇(PEG)通过二硫键将连接在PAMAM的表面,合成PSSPH聚合物;为了进一步提高PSSPH聚合物的主动靶向作用,增强其抗肿瘤活性,采用双功能化的HS-PEG2000-COOH偶联转铁蛋白(Tf)和PSSPH,合成Tf-PSSPH聚合物;同时选用PEG-PAMAM(PP)和PEG-PAMAM-His(PPH)两种聚合物作为对照,并在此基础上制备了PP/DOX、PPH/DOX、PSSPH/DOX和Tf-PSSPH/DOX四种复合物。采用氢谱(1H NMR)和动态光散射(DLS)对载体的结构及理化性质进行表征,透析袋法考察其体外药物释放行为;MTT法对聚合物的细胞毒性进行考察,并计算比较各复合物IC50值;以异硫氰酸罗丹明B(RBITC)为荧光探针标记四种聚合物,通过共聚焦显微镜(CLSM)考察其在胞内转运情况;采用荧光显微镜和流式细胞仪定性及定量地考察HepG2细胞对载药系统的摄取情况;通过不同的细胞抑制剂考察细胞内吞摄取途径,同时采用CLSM对摄取的复合物进行亚细胞定位研究;小动物活体成像技术和体内的抗肿瘤活性实验用于评价复合物体内靶向性和抗肿瘤效果;最后通过HE染色和TUNEL染色法考察复合物的组织毒性及肿瘤组织凋亡情况。结果:成功合成不同His修饰程度的PH,实验筛选得到最佳的His和PAMAM投料比为32:1;在此基础上进一步合成了PP、PPH、PSSPH、Tf-PSSPH四种聚合物,并包载化疗药物DOX,所制备的载药复合物粒径都在15~20 nm之间,具有较高的包封率,且载药量都在10%以上。体外释放结果显示Tf-PSSPH具有明显的pH氧化还原敏感性。在一定浓度范围内,各载体对肿瘤细胞均无明显毒性,表明该载体具有良好的生物相容性。Tf-PSSPH/DOX复合物对肿瘤的抑制率明显高于未经Tf修饰的复合物,同样细胞对Tf-PSSPH/DOX复合物的摄取高于PSSPH/DOX。细胞摄取机制表明Tf-PSSPH/DOX复合物主要通过Tf与TfR相结合,然后通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞内。CLSM结果表明聚合物进入细胞后主要分布在溶酶体中,并能从溶酶体快速逃逸出来进入细胞质中,从而在高浓度谷胱甘肽(GSH)的刺激下发生二硫键断裂,迅速释放其包载的药物。体内实验结果表明与PSSPH/DOX相比,Tf-PSSPH/DOX能快速到达肿瘤部位,且能明显抑制肿瘤的生长。HE染色实验结果显示,Tf-PSSPH/DOX相对于游离DOX组表现出良好的安全性,对正常组织器官无明显损伤。TUNEL染色实验进一步验证Tf-PSSPH/DOX组肿瘤凋亡情况较为明显。结论:本文成功构建了Tf-PSSPH/DOX多功能靶向给药系统。所制备的复合物具有较高的载药量和包封率,且体外释放呈现良好的pH-氧化还原双敏感。体内外实验表明Tf-PSPSH/DOX能够快速到达肿瘤部位,并高效释放药物,有效抑制肿瘤生长,而且能显著降低化疗药物的毒副作用,在癌症治疗中将具有潜在的应用前景。
【关键词】：聚酰胺-胺树状大分子 pH-氧化还原双敏感 组氨酸修饰 转铁蛋白 抗肿瘤
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-14
• 前言14-23
• 1 聚酰胺-胺树状大分子的研究进展14-16
• 1.1 结构特点14-15
• 1.2 主要应用15-16
• 2 环境响应性纳米给药系统16-18
• 3 组氨酸简介18-19
• 4 模型药物DOX简介19
• 5 转铁蛋白介导的主动靶向给药系统19-20
• 6 课题设计思路及研究内容20-23
• 6.1 本课题的设计思路20-21
• 6.2 本文主要研究内容21-23
• 第一章 PAMAM-His/DOX复合物的制备及评价23-34
• 一、PAMAM-His聚合物的合成及性质表征23-26
• 1 材料与仪器23
• 1.1 材料23
• 1.2 仪器23
• 2 实验方法23-24
• 2.1 PAMAM-His聚合物的合成23-24
• 2.2 PAMAM-His的1H-NMR结构确证24
• 2.3 PAMAM-His粒径和Zeta电位测定24
• 3 实验结果24-26
• 3.1 PAMAM-His的1H NMR分析24-25
• 3.2 PAMAM-His粒径和Zeta电位25-26
• 二、PAMAM-His/DOX复合物的制备及评价26-34
• 1 材料与仪器26
• 1.1 材料26
• 1.2 仪器26
• 1.3 细胞26
• 2 实验方法26-29
• 2.1 DOX标准曲线的构建26
• 2.2 PAMAM-His/DOX复合物的制备与表征26-27
• 2.3 PAMAM-His/DOX复合物的体外释放实验27-28
• 2.4 体外细胞毒性实验28
• 2.5 细胞摄取实验28
• 2.6 数据统计分析28-29
• 3 实验结果29-32
• 3.1 DOX的标准曲线的绘制29
• 3.2 复合物的表征29-30
• 3.3 复合物的体外释放30
• 3.4 体外细胞毒性30-32
• 3.5 细胞摄取实验32
• 4 本章小结32-34
• 第二章 Tf-PEG-SS-PAMAM-His聚合物的合成及性质表征34-46
• 1 材料与仪器34-35
• 1.1 材料34
• 1.2 仪器34
• 1.3 细胞34-35
• 2 实验方法35-38
• 2.1 聚合物的合成35-36
• 2.2 聚合物的结构确证36-37
• 2.3 粒径和Zeta电位测定37
• 2.4 RBITC标记的聚合物胞内转运考察37-38
• 3 结果与讨论38-45
• 3.1 聚合物的1H NMR分析38-40
• 3.2 转铁蛋白连接数量测定结果40
• 3.3 粒径和Zeta电位测定40-41
• 3.4 RBITC标记的聚合物胞内转运考察41-45
• 4 本章小结45-46
• 第三章 Tf-PAMAM-SS-PEG-His/DOX复合物的制备及评价46-52
• 1 材料与仪器46
• 1.1 材料46
• 1.2 仪器46
• 1.3 细胞46
• 2 实验方法46-48
• 2.1 复合物的制备46-47
• 2.2 复合物的表征47-48
• 3 实验结果48-51
• 3.1 复合物粒径、Zeta电位48
• 3.2 复合物的包封率及载药量48-49
• 3.3 体外pH-氧化还原双敏感释放行为考察49-51
• 4 本章小结51-52
• 第四章 复合物体外抗肿瘤活性及其机制研究52-67
• 1 材料与仪器52-53
• 1.1 材料52
• 1.2 仪器52
• 1.3 细胞52-53
• 1.4 实验动物53
• 2 实验方法53-57
• 2.1 细胞培养53
• 2.2 细胞毒性实验53-54
• 2.3 细胞摄取实验54-55
• 2.4 细胞内药物分布研究55
• 2.5 摄取机制考察55-56
• 2.6 数据统计分析56-57
• 3 实验结果57-65
• 3.1 细胞毒性实验结果57-58
• 3.2 细胞摄取实验结果58-59
• 3.3 细胞内药物分布研究59-61
• 3.4 摄取机制考察61-65
• 4 本章小结65-67
• 第五章 复合物体内抗肿瘤活性的研究67-75
• 1 材料与仪器67
• 1.1 材料67
• 1.2 仪器67
• 1.3 细胞67
• 1.4 实验动物67
• 2 实验方法67-69
• 2.1 HepG2荷瘤裸鼠模型的建立67-68
• 2.2 荷瘤裸鼠活体荧光成像实验68
• 2.3 荷瘤裸鼠体内抗肿瘤活性研究68
• 2.4 肿瘤和各主要器官的病理学观察68
• 2.5 TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡68-69
• 3 实验结果69-73
• 3.1 荷瘤裸鼠活体荧光成像实验69-70
• 3.2 体内抗肿瘤活性研究70-71
• 3.3 肿瘤和各主要器官的病理学观察71-73
• 3.4 TUNEL法检测肿瘤组织的凋亡73
• 4 本章小结73-75
• 全文总结75-77
• 后续工作与展望77-78
• 参考文献78-84
• 攻读硕士期间发表的论文84-85
• 缩略词表85-87
• 致谢87-88

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