κ-酪蛋白形成淀粉样纤维的抑制剂筛选与作用机理研究

发布时间：2017-09-27 19:10

  本文关键词：κ-酪蛋白形成淀粉样纤维的抑制剂筛选与作用机理研究

  更多相关文章： 淀粉样纤维 抑制 κ-酪蛋白 L-精氨酸 人参皂苷 相互作用 荧光光谱学

【摘要】：在生理条件下,κ-酪蛋白很容易发生错误聚集形成淀粉样纤维(fibril),该纤维在女性乳腺的沉积可能导致乳房淀粉样变性病。对κ-酪蛋白聚集过程的理解及其成纤维抑制剂的研究是治疗该类疾病的关键方向之一。RCMκ-酪蛋白是κ-酪蛋白的二硫键断裂后的产物,其结构与功能κ-酪蛋白基本相同,是用来研究κ-酪蛋白的淀粉样纤维沉淀很好的实验对象。本论文采用多种光谱学方法研究了L-精氨酸(ARG)与人参皂苷(GS)对RCMκ-酪蛋白成纤维的影响以及二者与RCMκ-酪蛋白的相互作用,并对抑制机理进行深入地探讨。(1)我们通过共振光散射法(RLS),荧光法,紫外吸收法和透射电子显微镜(TEM)研究了体外模拟生理条件下ARG对RCMκ-酪蛋白淀粉样fibril形成的影响及二者之间的相互作用。结果表明ARG可以抑制RCMκ-酪蛋白fibril的生成。RLS荧光的增强证明,二者发生相互作用,并形成了新的复合物。另外,ARG对RCMκ-酪蛋白的荧光具有强烈的静态淬灭作用。通过热力学参数(ΔH,ΔS和ΔG)的分析表明,结合过程由熵驱动,自发进行,且氢键和范德华力在此过程中发挥了主要作用。通过FRET的测量,RCMκ-酪蛋白Trp97与ARG的距离为2.94 nm。同步荧光实验表明,ARG使RCMκ-酪蛋白Trp97所处微环境极性减小且更加难于暴露于溶剂,这可能是抑制RCMκ-酪蛋白从天然状态向纤维态转变的关键因素。(2)我们采用Th T荧光法,TEM以及内源荧光法研究了人参皂苷Rb1,Rg1,Rc和Re对RCMκ-酪蛋白fibril形成的影响。研究结果表明Rg1和Rb1可明显抑制RCMκ-酪蛋白fibril的形成,二者均可以抑制fibril快速生长期的生长速率,同时降低fibril最终生成数量;相反,由TEM观察得知Re促进fibril的生成,而Rc影响较小。内源荧光实验显示RCMκ-酪蛋白单独孵育24 h后最大发射波长λmax由336 nm蓝移至331nm,意味着Trp97残基周围的环境发生了变化。而当加入Rg1后,蛋白最大发射波长保持不变,表明Rg1通过稳定RCMκ-酪蛋白的自然状态从而阻止其fibril的形成。另外,我们研究了人参皂苷的化学结构与其对蛋白淀粉样fibril生成的影响的关系。(3)我们利用荧光法和紫外法研究了人参皂苷Rg1,Rb1和Re与RCMκ-酪蛋白相互作用。RLS荧光X椙恐っ鱃S与RCMκ-酪蛋白生成了新的复合体,同时我们对相关的热力学参数(ΔH,ΔS和ΔG)进行了计算。我们采用稳态紫外吸收实验来验证二者是否形成了基态复合物,得出与RLS实验一致的结论。根据相关荧光数据我们得到了不同温度下GS与RCMκ-酪蛋白作用时的结合常数和结合位点数。通过FRET理论,我们计算了蛋白97位色氨酸残基与GS的距离。加入GS后蛋白荧光寿命延长,表明疏水作用在GS与RCMκ-酪蛋白的结合中有重要作用。色氨酸残基的同步荧光数据显示Rg1和Rb1使其周围溶液环境极性下降。根据所有观察结果,我们认为Rg1和Rb1与RCMκ-酪蛋白结合形成复合物后改变了蛋白分子的空间构象及其表面的物理性质,从而可以抑制fibril的形成。
【关键词】：淀粉样纤维 抑制 κ-酪蛋白 L-精氨酸 人参皂苷 相互作用 荧光光谱学
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• ABBREVIATION8-13
• 第1章 绪论13-24
• 1.1 蛋白错误聚集/成纤维所致淀粉样变性病13-14
• 1.2 乳房淀粉样变性病14-15
• 1.3 κ-酪蛋白聚集/成纤维研究进展15-18
• 1.3.1 κ-酪蛋白形成淀粉样纤维的关键部位15-16
• 1.3.2 寡聚体的解聚是 κ-酪蛋白形成淀粉样纤维的关键步骤16-17
• 1.3.3 κ-酪蛋白聚集/成纤维的抑制剂研究现状17-18
• 1.4 L-精氨酸18-19
• 1.5 人参皂苷19-20
• 1.6 检测手段20-22
• 1.6.1 ThT荧光检测20-21
• 1.6.2 同步荧光法21
• 1.6.3 共振散射技术21-22
• 1.6.4 荧光共振能量转移22
• 1.6.5 其他方法22
• 1.7 研究目的及内容22-24
• 1.7.1 研究目的22-23
• 1.7.2 主要研究内容23-24
• 第2章 RCMκ-酪蛋白的制备24-34
• 2.1 引言24
• 2.2 材料与仪器24-25
• 2.2.1 材料24-25
• 2.2.2 仪器25
• 2.3 DEAE阴离子交换法分离纯化酪蛋白成分25-27
• 2.3.1 酪蛋白制备25-26
• 2.3.2 层析条件26
• 2.3.3 结果与分析26-27
• 2.4 酪蛋白成分的反相高效液相色谱检测27-31
• 2.4.1 样品处理27
• 2.4.2 色谱条件27-28
• 2.4.3 结果与分析28-31
• 2.5 RCMκ-酪蛋白的制备和SDS-PAGE鉴定31-34
• 2.5.1 RCMκ-酪蛋白的制备31
• 2.5.2 SDS-PAGE电泳31-33
• 2.5.3 结果与分析33-34
• 第3章 ARG对RCMκ-酪蛋白成淀粉样纤维的影响及二者相互作用的光谱学研究34-44
• 3.1 引言34-35
• 3.2 结果与讨论35-43
• 3.2.1 ARG抑制RCMκ-酪蛋白fibril的形成35-36
• 3.2.2 ARG与RCMκ-酪蛋白相互作用的光谱学研究36-43
• 3.3 结论43-44
• 第4章 GS对RCMκ-酪蛋白成淀粉样纤维的影响44-51
• 4.1 引言44-45
• 4.2 结果45-49
• 4.2.1 Rg_1和Rb_1抑制RCMκ-酪蛋白fibril的形成45-47
• 4.2.2 Rb_1和Rg_1使RCMκ-酪蛋白天然状态保持稳定47-48
• 4.2.3 Re促进RCMκ-酪蛋白fibril的形成而Rc对fibril形成无影响48-49
• 4.3 讨论49-50
• 4.4 结论50-51
• 第5章 GS与RCMκ-酪蛋白相互作用的光谱学研究51-65
• 5.1 引言51-52
• 5.2 结果与讨论52-64
• 5.2.1 GS对RCMκ-酪蛋白fibril生成的影响52-53
• 5.2.2 RLS表征GS与RCMκ-酪蛋白的相互作用53-54
• 5.2.3 RCMκ-酪蛋白与GS发生相互作用并形成了基态复合物54-55
• 5.2.4 RCMκ-酪蛋白结合GS后的荧光寿命55-57
• 5.2.5 GS与RCMκ-酪蛋白的结合导致荧光显著增强且伴随着蛋白结构的改变57-58
• 5.2.6 GS改变了RCMκ-酪蛋白Trp97所处微环境的极性58-59
• 5.2.7 GS通过疏水作用力与RCMκ-酪蛋白结合59-61
• 5.2.8 GS与RCMκ-酪蛋白发生结合反应的结合常数及位点数61-62
• 5.2.9 FRET计算GS与RCMκ-酪蛋白Trp 97的距离62-63
• 5.2.10 Rg_1和Rb_1降低了RCMκ-酪蛋白进入溶液的能力并阻止了其由寡聚体解聚为单体63-64
• 5.3 结论64-65
• 第6章 RCMκ-酪蛋白成纤维的抑制与机制研究实验部分65-67
• 6.1 材料与仪器65
• 6.1.1 材料65
• 6.1.2 仪器65
• 6.2 方法65-67
• 6.2.1 ThT荧光实验65
• 6.2.2 TEM实验65-66
• 6.2.3 荧光光谱实验66
• 6.2.4 共振散射荧光实验66
• 6.2.5 荧光寿命测量66
• 6.2.6 同步荧光实验66
• 6.2.7 共振能量转移实验66-67
• 第7章 结论和建议67-69
• 参考文献69-78
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果78-80
• 致谢80

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 陈凡波;κ-酪蛋白形成淀粉样纤维的抑制剂筛选与作用机理研究[D];吉林大学;2016年

2 张莹;基于纳米磁珠的牛乳中κ-酪蛋白快速检测方法的建立[D];吉林大学;2014年

，

本文编号：931403