缝隙连接在异丙酚保护脑缺血再灌注损伤中的作用及可能机制

发布时间：2017-09-29 18:09

  本文关键词：缝隙连接在异丙酚保护脑缺血再灌注损伤中的作用及可能机制

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【摘要】：目的:1.探讨缝隙连接在异丙酚抗大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及可能的分子机制方法:1.采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型;为了对异丙酚脑保护作用的浓度进行筛选,将50只SPF级雄性SD大鼠随机分为5组:假手术(sham)组、缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组、低(I/R+P_(25),25mg/kg)、中(I/R+P_(50),50mg/kg)、高剂量(I/R+P_(100),100mg/kg)异丙酚干预缺血再灌注组。为了研究异丙酚脑保护作用的分子机制,进一步将50只SPF级雄性SD大鼠随机分为5组:sham组、I/R组、I/R+P_(100)组、甘珀酸(carbenoxolone,CBX)干预缺血再灌注(I/R+CBX)组和高剂量的异丙酚+甘珀酸干预缺血再灌注(I/R+P_(100)+CBX)组。采用Longa’s法对其进行神经行为学评分;TTC染色法检测大鼠脑梗死体积的变化;Western Blot法检测大鼠脑组织中缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)、蛋白激酶C(PKC)以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达变化。2.利用原代培养的星形胶质细胞,制备缺氧/复氧损伤的细胞模型。为了对异丙酚保护细胞缺氧/复氧损伤的浓度进行筛选,实验分为正常对照(control)组、缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)组、低(H/R+P_(25),25μmol/L)、中(H/R+P_(50),50μmol/L)、高剂量(H/R+P_(100),100μmol/L)异丙酚干预缺氧/复氧组。为了研究异丙酚保护作用机制,将实验进一步分为:control组、H/R组、H/R+P_(100)组、异丙酚高剂量+缝隙连接增强剂(retinoid acid,RA)干预缺氧/复氧(H/R+P_(100)+RA)组、异丙酚高剂量+缝隙连接抑制剂(carbenoxolone,CBX)干预缺氧/复氧(H/R+P_(100)+CBX)组和异丙酚高剂量+PKC激酶抑制剂GF109203X干预缺氧/复氧(H/R+P_(100)+GF)组。分别采用MTT法和Hoechst 33258检测星形胶质细胞的存活率及细胞凋亡情况;荧光示踪法检测星形胶质细胞间缝隙连接功能的变化;Western Blot检测星形胶质细胞中Cx43、PKC以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达变化。结果:1.各实验组大鼠神经行为学评分和TTC染色的结果显示:与I/R组相比,除I/R+P_(25)组外,I/R+P_(50)、I/R+P_(100)组神经行为学评分和大鼠脑梗死体积百分率都有不同程度的降低,且I/R+P_(100)组效果更佳,甘珀酸可以进一步增强异丙酚对大鼠脑I/R损伤的保护作用。2.各实验组大鼠脑组织中Cx43、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表达变化的检测结果显示:较sham组,I/R组的Cx43蛋白表达以及Bax与Bcl-2比值显著增高,而PKC蛋白表达水平显著降低;与I/R组相比,I/R+P_(100)组的Cx43蛋白表达及Bax与Bcl-2比值明显降低,而PKC蛋白表达则明显增多,且甘珀酸可以增强异丙酚对蛋白表达变化的作用。3.星形胶质细胞纯度的鉴定结果显示:星形胶质细胞纯度为96.3%±1.2%,可以用于后续的实验。4.星形胶质细胞存活率检测结果显示:与H/R组相比,除H/R+P_(25)组外,H/R+P_(50)、H/R+P_(100)组细胞存活率均明显增高,且高剂量的异丙酚增高效果更佳;甘珀酸使异丙酚对星形胶质细胞H/R损伤的保护作用增强,但维甲酸和GF却使异丙酚的保护作用减弱。5.星形胶质细胞间缝隙连接功能的检测结果显示,与control组相比,H/R组的星形胶质细胞间缝隙连接功能明显增强;与H/R组相比,H/R+P_(100)组的缝隙连接功能显著降低,且甘珀酸可以进一步降低H/R+P_(100)组的缝隙连接功能;较H/R+P_(100)组,H/R+P_(100)+RA组和H/R+P_(100)+GF组的细胞间的缝隙连接功能则显著增强。6.星形胶质细胞中Cx43和PKC蛋白表达变化的检测结果显示,与control组相比,H/R组的星形胶质细胞中Cx43蛋白表达明显增高,PKC蛋白表达显著降低;与H/R组相比,H/R+P_(100)组的Cx43蛋白表达明显降低,而PKC蛋白表达明显增高,且甘珀酸可以增强异丙酚的这一作用;较H/R+P_(100)组,H/R+P_(100)+RA组和H/R+P_(100)+GF组的Cx43蛋白表达均有不同程度的增加,但PKC蛋白表达均有不同程度降低。7.星形胶质细胞凋亡情况检测结果显示:与control组相比,H/R组细胞凋亡率明显增加;与H/R组相比,H/R+P_(100)组细胞凋亡率明显降低,且甘珀酸可以增强异丙酚的这一作用;较H/R+P_(100)组,H/R+P_(100)+RA组和H/R+P_(100)+GF组的细胞凋亡率均有不同程度的增加。8.各实验组星形胶质细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2蛋白表达变化检测结果显示:与control组相比,H/R组Bax与Bcl-2的比值显著增高;与H/R组相比,使用高剂量异丙酚后Bax与Bcl-2的比值明显降低,且甘珀酸可以使H/R+P_(100)组Bax与Bcl-2的比值进一步降低;较H/R+P_(100)组,H/R+P_(100)+RA组和H/R+P_(100)+GF组的Bax与Bcl-2的比值均有不同程度的增高。结论:1.异丙酚对脑I/R损伤有一定的保护作用,尤其以高剂量(100mg/kg)的异丙酚保护作用更佳。2.异丙酚对脑I/R损伤保护作用的机制可能与通过PKC信号通路抑制缝隙连接功能有关。3.异丙酚降低脑I/R损伤的星形胶质细胞凋亡率可能与其降低Bax和Bcl-2的比值有关。
【关键词】：脑缺血再灌注损伤 异丙酚 蛋白激酶C 缝隙连接蛋白43 缝隙连接 凋亡
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-20
• 1.材料13-14
• 2.主要仪器设备14
• 3.方法14-19
• 4.统计学处理方法19-20
• 实验结果20-35
• 1.异丙酚对脑I/R损伤大鼠神经功能评分的影响20
• 2.异丙酚对脑I/R损伤大鼠脑梗死体积的影响20-22
• 3.异丙酚对脑I/R损伤大鼠脑组织中Cx43、PKC、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响22-23
• 4.异丙酚对脑I/R损伤大鼠神经功能评分的影响可能与其抑制缝隙连接功能有关23-24
• 5.异丙酚对脑I/R损伤大鼠脑梗死体积的影响可能与其抑制缝隙连接功能有关24-25
• 6.异丙酚对脑I/R损伤大鼠脑组织中Cx43、PKC、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响可能与其抑制缝隙连接功能有关25-27
• 7.星形胶质细胞形态学观察和纯度鉴定27-28
• 7.1 星形胶质细胞形态学观察27
• 7.2 GFAP鉴定星形胶质细胞纯度27-28
• 8.异丙酚对H/R损伤星形胶质细胞存活率的影响28-29
• 9.异丙酚对H/R损伤星形胶质细胞存活率的影响可能与其抑制缝隙连接功能有关29-30
• 10.异丙酚对H/R损伤星形胶质细胞缝隙连接功能的影响30-31
• 11.异丙酚对H/R损伤星形胶质细胞中Cx43、PKC蛋白表达的影响可能与其抑制缝隙连接功能有关31-32
• 12.异丙酚对H/R损伤星形胶质细胞凋亡的影响可能与其抑制缝隙连接功能有关32-33
• 13.异丙酚对H/R损伤星形胶质细胞中Bax、Bcl-2 蛋白表达可能与其抑制缝隙连接功能有关33-35
• 讨论35-39
• 结论39
• 课题创新点39-40
• 参考文献40-45
• 致谢45-46
• 附录A 主要英文缩略词表46-47
• 附录B 主要试剂配制方法47-50
• 附录C 个人简历及发表文章情况50-51
• 附录D 综述 异丙酚对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究51-59
• 参考文献56-59

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本文编号：943456