酸敏纳米载体联合传输辛伐他汀和nogginsiRNA协同促进MC3T3-E1细胞成骨分化基因调控的研究

发布时间：2017-10-01 19:06

  本文关键词：酸敏纳米载体联合传输辛伐他汀和nogginsiRNA协同促进MC3T3-E1细胞成骨分化基因调控的研究

  更多相关文章： 阳离子纳米载体 pH敏感 联合传输 辛伐他汀 noggin siRNA 基因治疗 骨缺损

【摘要】：研究背景骨缺损是临床上常见的并发症,也是临床上较为棘手的问题,多由于创伤、感染及肿瘤切除后等因素所导致。骨不连引发的骨缺损多为原始创伤严重、急诊处理不当引起,若伴有骨感染时治疗会更为困难。临床上多伴有肌肉萎缩、骨质疏松、关节僵硬等并发症；其他并发症如疼痛、肢体功能障碍等不仅给患者带来了极大身体和心理上的负担,同时也给患者带来了沉重的经济负担。由于创伤后部分骨缺损的治疗效果欠佳,过去截肢常成为此类疾病的最终治疗方式。大量松质骨移植对该病的治疗是一个重大突破。骨搬运与骨牵引主要用于2-10cm骨缺损,但存在骨折对接部分延迟愈合,治疗时间长等问题；游离骨皮瓣则用于5-12cm的缺损,常见的临床并发症为移植物不稳和术后易再骨折。骨替代材料为另一个研究热点,但仍不能达到治疗创伤后部分骨缺损的目的。虽然传统方法能在一定程度促进骨折的愈合,且获得一定程度的成功,但治疗操作难度较大,治疗周期较长,需反复多次手术等并发症限制了其广泛应用。组织工程骨在解决移植骨的问题上是一个重大的突破。但就目前而言,尚无将组织工程骨成功转化为自体骨的核心技术。所以必须寻找一种新的方法促进骨生成。BMP-2因能有效地促进骨折端的愈合而被广泛应用于临床,但存在需要量大,供应不足,本身制备困难,价格高昂等问题,严重限制了其临床的广泛应用。辛伐他汀为临床上主要的调血脂的药物,研究发现辛伐他汀可促进成骨细胞表达BMP-2,进而促进骨折的愈合。但小分子的游离辛伐他汀应用存在水溶性低、易在肝脏代谢、稳定性差、临床应用剂量大和局部注射细胞毒性大等问题,也限制了其应用。RNAi技术自从其机制被发现以来,已被广泛被沉默各种靶基因的的治疗,具有广阔应用前景。本课题也运用RNAi技术,通过下调noggin基因的表达,去除其抑制BMP-2的作用,从另一个方面促进MC3T3-E1细胞成骨。如何将小分子siRN A输送到细胞也是现阶段必须解决的问题,过去常运用病毒载体进行细胞转染,结果表明病毒载体的细胞转染效率虽高,但存在生物安全性问题。另外,siRNA分子在体内应用时存在体内循环不稳定,容易被巨噬细胞吞噬、被核酸酶降解等问题,且分子量较大、本身带有负电荷也使得其难以穿过带同样负电的细胞膜,不能发挥沉默目的基因的作用,故必须寻找一种新的有效的方式来促进其作用。本课题提出利用多功能纳米药物传输技术,索出一种临床适用、安全经济的联合重建成骨的治疗方案。首先,根据辛伐他汀先诱导VEGF促进血管化再通过诱导BMPs促进成骨的顺序作用机理,应用辛伐他汀促进植入骨的成骨；其次,利用RNA干扰技术下调BMPs的拮抗蛋白基因noggin的表达,辛伐他汀与noggin siRNA(针对noggin的siRNA)联用,从而在BMP s转录和蛋白相互作用两个水平同时促进骨生成。但siRNA和辛伐他汀直接用于治疗存在给药效率低和易降解的问题,也很难被共同传输到骨形成区。因此,利用多功能纳米载体将noggin siRNA和辛伐他汀同时靶向传输到成骨区,促进成骨的发生,发挥其1+12的协同增效作用,同时也提高辛伐他汀的给药效率,达到减少辛伐他汀剂量和避免可能的副作用。因此,本课题设计合成了一种新型的三元嵌段聚合物聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸(N,N-二异丙基乙二胺-苄胺){nPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA)}的酸性敏感纳米载体,可用于联合传输辛伐他汀和noggin siRNA。从而可同时发挥药物及基因治疗的双重效果。辛伐他汀作用于成骨细胞后会促进BMP-2的表达,而noggin作为BMP-2的特异性拮抗剂,会抑制BMP-2的促进成骨的作用。利用noggin siRNA可下调BMP-2诱导的noggin升高水平,将药物治疗和RNA干扰疗法有机地结合起来,利用二者协同作用以达到促进成骨治疗骨不连的目的。本文主要通过体外实验来验证酸敏响应性双载体对MC3T3.E1细胞的作用,探讨其在治疗骨缺损方面的应用潜力。研究目的本文的研究目的为设计一种酸敏纳米载体,对其结构和形状进行表征,进一步研究其负载辛伐他汀和noggin siRNA的能力,空白纳米载体对MC3T3-E1细胞的毒性作用,负载辛伐他汀的纳米载体对MC3T3-E1细胞的增殖作用；同时研究其体外细胞内吸收定位情况,进入细胞后的释放情况；最后在基因、蛋白和碱性磷酸酶染色等方面研究纳米载体同时负载辛伐他汀和siRNA对MC3T3-E1细胞的作用情况。研究方法1、化学方法合成聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA),1H NMR核磁谱对聚合物进行测试表征；2、BI-200SM动态光散射系统(Brookhaven Instruments)对不同N/P比的纳米载体复合物进行粒径与Zeta电位测量,所得的每组样品数据,取5次测量的平均值；3、通过电镜和绘制时间-累积释放量图分别验证pH值为5.0和7.4时,在只负载辛伐他汀或同时负载辛伐他汀和siRNA的纳米复合物中,辛伐他汀从纳米载体中释放的体外实验；4、琼脂糖凝胶实验验证不同N/P比纳米载体与noggin siRNA的复合情况,按照纳米载体是否负载辛伐他汀将其分为两组；5、Cell Counting Kit-8法(CCK8法)检测不同浓度无负载辛伐他汀纳米载体(B-mPB P)对MC3T3-E1细胞的毒性作用；CCK8法检测游离不同浓度辛伐他汀和负载辛伐他汀纳米载体(D-mPBP) 对 MC3T3-E1细胞增殖的影响；6、应用激光共聚焦(CLSM)定性和流式细胞术定量分析检测纳米载体的细胞内吸收情况；7、Real-time PCR实验验证D-mPBP中不同浓度辛伐他汀和当浓度luM时,不同作用时间对noggin及BMP-2基因表达的影响：D-mPBP中辛伐他汀浓度为10uM时,不同浓度noggin siRNA 对 noggin及BMP-2基因表达的影响；8、Real-time PCR实验验证noggin siRNA浓度为120nnM时,D-mPBP中辛伐他汀浓度为1,10 uM时,noggin及BMP-2基因表达情况,同时用Western blotting实验、碱性磷酸酶和茜素红成骨染色进一步验证；结果1、成功合成了聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA),'H NMR核磁谱图显示聚合物被成功合成：2、通过动态光散射系统对不同N/P比的D-mPBP/siRN A纳米载体复合物进行粒径和表面电位测定。当N/P=10时,纳米载体复合物具有相对较小粒径(40nm)和较弱的表面正电荷(+8mV)。因此,当纳米载体复合物的N/P为10时,其具有较高的细胞转染效率；3、透射电镜表征和辛伐他汀体外释放实验表明在pH 7.4时,粒径较为均匀、分布在40 nm左右,此时药物呈缓慢释放状态；当pH 5.0时,胶束膨大聚集,表现出快速释放行为；4、琼脂糖凝胶阻滞实验结果：当N/P比为10时,siRNA被完全复合而无条带跑出,阳离子纳米载体无论是否负载辛伐他汀都不会影响其负载siRNA的能力；5、CCK8法验证空白纳米载体细胞毒性实验：以N/P=10与siRNA进行复合时,当空白纳米载体的浓度高达430 ug/mL时,MC3T3-E1细胞的存活率仍高达90.5%,此时纳米载体复合了siRNA,中和了一部分正电,从而降低了其对细胞的毒性作用；6、不同浓度的游离辛伐他汀对细胞并无毒性或增殖作用；负载辛伐他汀的纳米载体对细胞增值有一定作用,但当浓度为10uM时却抑制细胞的增殖；7、激光共聚焦实验及流式细胞技术结果：证实纳米载体复合物能被MC3T3-E1细胞高效内吞,转染率高达86.4%,进入细胞溶酶体后药物缓慢释放,结果显示纳米载体复合物是缓慢进入细胞的,10min时部分进入细胞,30min时进入更多,到60min时已大部分进入并开始释放分离,120min时基本完全释放；8、荧光定量PCR结果：纳米载体负载辛伐他汀的浓度为1 uM时的作用效果最好,且最佳作用时间为48h；当noggin siRN A的浓度越高,对noggin的抑制作用越好,当高达为120 nM时,对noggin的抑制作用最好；9、当noggin siRNA浓度为120nM时,辛伐他汀的浓度为1uM时的作用效果最佳。结果得到了Western blotting实验、碱性磷酸酶和茜素红染色结果进一步验证。结论本文主要通过体外实验来探讨酸敏响应性双载体在治疗骨缺损方面的应用潜力。本课题成功合成了聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸(N,N二异丙基乙二胺-苄胺)(mPEG-g-bPEI-g-PAsp (DIP-BA))的酸性敏感纳米载体,运用透射电镜、粒径电位仪等测试了聚合物纳米载体的形貌和粒径,实验结果表明,我们成功制备了粒径较小、分布均匀的具有酸敏内核的纳米载体,其粒径约为40nm,可以避免其快速地被肾脏排除和被RES摄取。从另一方面也增加了药物的水溶性、延长了药物的血液循环时间以及改善治疗效果。生物学实验结果强有力地证明：应用pH敏感性阳离子纳米载体协同运输辛伐他汀和noggin siRNA能够协同促进细胞成骨发生。这种协同作用主要体现在辛伐他汀诱导BMP-2的表达,从而引发的noggin的上调可被同时运输的nogginsiRNA有效地降低,从而降低了noggin抑制成骨的作用,二者协同更好地促进了成骨的发生。结果进一步表明酸敏纳米双载体为骨组织工程的发展和骨缺损的治疗提供了一个新的思路,我们将进一步通体内实验进行验证。
【关键词】：阳离子纳米载体 pH敏感 联合传输 辛伐他汀 noggin siRNA 基因治疗 骨缺损
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 前言16-29
• 1.1 骨缺损的治疗16-18
• 1.2. BMPs在促成骨中的应用18-19
• 1.3 辛伐他汀在促成骨中的应用19-20
• 1.4 Noggin基因和RNA干扰技术研究进展20-21
• 1.5 药物传输纳米载体的研究现状21-22
• 1.6 课题的提出和创新点22-23
• 参考文献23-29
• 第二章 pH敏感纳米载体联合传输noggin siRNA和辛伐他汀促进MC3T3-E1细胞成骨分化基因调控的研究29-69
• 2.1 引言29-32
• 2.2 实验材料与方法32-37
• 2.3 实验方法37-47
• 2.4 结果47-62
• 2.5 讨论62-64
• 2.6 小结64
• 参考文献64-69
• 在职期间学术成果69-70
• 致谢70-72

【共引文献】

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本文编号：955118