黄豆苷类药物DZ18抗血小板聚集作用及机制研究

发布时间：2017-10-03 23:18

  本文关键词：黄豆苷类药物DZ18抗血小板聚集作用及机制研究

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【摘要】：血栓性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病。血小板在血栓形成过程中发挥了重要作用,因此,研发抗血小板药物对血栓性疾病的预防和治疗有着十分重要的意义。血小板膜上有多种受体,在诱导剂的刺激下,血小板会从静息状态激活为活化状态,血小板形态和结构发生变化,并通过纤维蛋白原相互连接、黏附成团,导致血栓的形成。由于血小板的活化在血栓形成中发挥了主要作用,因此抗血小板治疗是临床上预防和治疗血栓性疾病的主要手段。DZ18是一种全新的黄豆苷类化合物。实验室前期研究结果表明,在体内试验中,DZ18在不同类型血小板聚集模型上,均表现出明显剂量依赖性抗血栓形成作用。本研究主要观察了DZ18在体外对不同诱导剂诱导的血小板聚集的抑制作用,并研究其作用机制,以期寻找其作用靶点。实验结果显示：(1)体外试验中,DZ18剂量依赖性地抑制二磷酸腺苷(ADP)、胶原(COLL)、U46619(血栓烷A2类似物)引起的血小板聚集,提示其可能是一种多靶点、广谱抗血小板药,为了探讨其可能的作用机制及作用靶点,我们又研究了DZ18对三种诱导剂作用的信号通路的影响。(2)ADP在血小板膜上有两种G蛋白受体：P2Y1和P2Y12。P2Y1偶联Gq蛋白,激活磷脂酶C(PLC),水解PIP2产生IP3,IP3开启内质网钙离子通道,增加胞浆内钙离子浓度,引起血小板聚集；P2Y12偶联Gi蛋白,抑制腺苷酸环化酶(AC)活性,降低cAMP含量,引起血小板聚集。本研究结果显示,DZ18在与P2Y1受体拮抗剂MRS2179、P2Y12受体拮抗剂MRS2395联合给药时,表现出显著的协同拮抗作用；同时,DZ18明显逆转了ADP引起的磷脂酶C磷酸化水平下降；DZ18明显抑制了ADP引起的IP1含量升高,但对PLC激动剂引起的IP1含量升高则无明显影响。以上结果表明,DZ18可能作用于P2Y1-PLC信号通路,抑制ADP引起的血小板聚集。(3)PGE1可使血小板中cAMP含量升高,ADP结合P2Y12受体,降低cAMP含量,研究结果显示,DZ18则明显逆转ADP引起的cAMP含量下降；单独给予DZ18时,cAMP含量同样有显著升高,提示DZ18可能通过升高cAMP含量抑制血小板聚集。(4)花生四烯酸在环氧化酶作用下生成PGI2和TXA2,PGI2和TXA2的平衡失调是造成血小板聚集,血管痉挛收缩、血栓形成的原因之一。本研究检测了DZ18对大鼠血小板PGI2和TXA2含量的影响。结果显示,AA刺激后TXA2含量明显上升,同时PGI2含量明显下降,而DZ18对PGI2和TXA2含量变化无明显影响,提示DZ18可能并非通过环氧化酶通路抑制血小板聚集。(5)糖蛋白GPⅡbⅢa是血小板活化的最终共同通路,血小板通过GPⅡbⅢa受体位点相互连接、黏附成团。本研究通过流式细胞术检测显示,诱导剂刺激后,GPⅡbⅢa阳性率有明显上升,而DZ18对GPⅡbⅢa阳性率上升没有抑制作用,表明DZ18可能不通过竞争性结合GPⅡbⅢa受体位点抑制血小板聚集；同时我们观察了DZ18对血小板活化功能的影响,结果显示,DZ18显著降低了刺激后血小板表面CD62p的表达,抑制了血小板活化。综合上述结果,我们得到如下结论：DZ18可显著抑制了多种诱导剂引起的血小板聚集、活化；DZ18可能通过拮抗P2Y1受体,抑制PLC活性,降低胞浆内钙离子浓度,抑制ADP引起的血小板聚集；同时DZ18通过升高胞浆内cAMP含量,从而达到抑制血小板聚集的作用。
【关键词】：DZ18 抗血小板药 信号通路
【学位授予单位】：信阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 缩略词表11-12
• 第1章 引言12-17
• 1.1 血栓的形成12
• 1.2 血小板在血栓形成中的作用12-13
• 1.3 抗血小板药分类13-15
• 1.3.1 环氧化酶(COX)抑制剂13-14
• 1.3.2 二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)受体拮抗剂14
• 1.3.3 磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)抑制剂14-15
• 1.3.4 糖蛋白ⅡbⅢa(GPⅡb/Ⅲa)受体拮抗剂15
• 1.4 研究思路15-17
• 第2章 材料与方法17-27
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 实验动物17
• 2.1.2 试剂和药品17-18
• 2.1.3 仪器18
• 2.1.4 溶液配制18-19
• 2.2 实验方法19-26
• 2.2.1 富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)和贫血小板血浆(platelet poorplasma,PPP)的制备19-20
• 2.2.2 比浊法测定血小板聚集率20
• 2.2.3 全血法流式细胞术检测CD41/CD61、CD62p表达20-21
• 2.2.4 Western blot实验21-22
• 2.2.5 IP_1含量测定22-23
• 2.2.6 ELISA检测cAMP含量23-24
• 2.2.7 TXB2含量测定24-25
• 2.2.8 6-keto-PGF_(1α)含量测定25-26
• 2.3 结果统计26-27
• 第3章 实验结果27-43
• 3.1 DZ18对大鼠血小板聚集的抑制作用27-30
• 3.1.1 DZ18对ADP诱导的大鼠血小板聚集的抑制作用27-28
• 3.1.2 DZ18对U46619诱导的大鼠血小板聚集的抑制作用28
• 3.1.3 DZ18对COLL诱导的大鼠血小板聚集的抑制作用28-29
• 3.1.4 小结29-30
• 3.2 DZ18对血小板活化及GPⅡb/Ⅲa信号通路的影响30-31
• 3.2.1 DZ18对血小板活化的影响30-31
• 3.2.2 DZ18对GPⅡb/Ⅲa信号通路的影响31
• 3.3 DZ18对ADP诱导的血小板聚集信号通路的作用31-38
• 3.3.1 DZ18与P2Y_1受体拮抗剂合用对ADP诱导的血小板聚集的作用32-33
• 3.3.2 DZ18与P2Y_(12)受体拮抗剂合用对ADP诱导的血小板聚集的作用33-34
• 3.3.3 DZ18对磷脂酶C(PLC)和磷酸化磷脂酶C(p-PLC)表达的影响34-35
• 3.3.4 DZ18对IP_1含量的影响35-36
• 3.3.5 DZ18对cAMP含量的影响36-38
• 3.3.6 小结38
• 3.4 DZ18对血栓素A_2信号通路的作用38-39
• 3.5 讨论39-43
• 第4章 结论43-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-50
• 攻读学位期间获得与学位论文相关的科研成果50

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