GenoType MTBDRsl分子线性探针法诊断二线抗结核药物和乙胺丁醇耐药性的研究

发布时间：2017-10-04 07:11

  本文关键词：GenoType MTBDRsl分子线性探针法诊断二线抗结核药物和乙胺丁醇耐药性的研究

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【摘要】：背景以及目的:耐药结核病(DR TB)尤其是广泛耐药结核病(XDR TB)的出现严重阻遏了全球结核病的控制工作。广泛耐药结核病患者病情重、治疗时间长、治疗毒副作用大、死亡率高。因此,快速而准确的诊断广泛耐药结核病有利于及时制定化疗方案和采取控制措施,减少疾病的进一步传播以及提高患者的治疗成功率。目前,由于结核分枝杆菌生长缓慢的特点,建立在固体培养基或者液体培养基础上的传统药敏检测方法耗时数周至数月才能提供药敏结果,远不能满足临床诊断和治疗的需要。随着分子生物学技术的发展,利用基因突变与耐药的关联性,对耐药基因突变位点进行检测,能快速得到药敏结果,及时地诊断DR TB。商品化的试剂盒Geno Type MTBDRsl利用分子线性探针技术,对结核分枝杆菌复合群及其耐氟喹诺酮类药物、氨基糖苷类/环肽类药物和乙胺丁醇耐药基因进行分子生物学检测。通过检测最有意义的gyr A基因突变(编码DNA促旋酶)确定对氟喹诺酮类药物的耐药性,检测16S r RNA基因(rrs)确定对氨基糖苷类/环肽类药物的耐药性,检测emb B基因(与emb A基因和emb C基因共同编码阿拉伯糖基转移酶)确定对乙胺丁醇的耐药性。该技术可以一次同时检测多种耐药基因位点,可以直接检测临床涂片阳性标本,不需要昂贵的仪器设备,具有简便、快速、实用、费用低廉的特点。本课题采用Geno Type MTBDRsl分子线性探针技术检测左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素和乙胺丁醇耐药基因突变,以期达到快速诊断广泛耐药结核病以及乙胺丁醇耐药性的目的,及时为临床治疗提供可靠的化疗依据。因此,应用Geno Type MTBDRsl分子线性探针法快速检测痰标本中结核分枝杆菌二线抗结核药物和乙胺丁醇耐药性具有重要的临床意义。方法:2013年6月-2014年6月期间,北京胸科医院189例患者通过Geno Type MTBDRplus分子线性探针法诊断为耐多药结核病,其痰标本被进一步纳入到基因型MTBDRsl分子线性探针法诊断广泛耐药结核病的研究中。我们采用以罗氏培养和快速培养为基础的表型耐药方法作为对照,统计Geno Type MTBDRsl分子线性探针法诊断的准确性,同时分析北京胸科医院二线抗结核药物和乙胺丁醇耐药相关基因的突变情况,并采用基因测序的方法分析检测结果不一致的痰标本。结果:1.基因型MTBDRsl分子线性探针法检测结果的整体有效率为96.8%(183/189)。检测左氧氟沙星耐药性的灵敏度和特异度分别是81.6%和91.5%;检测阿米卡星耐药性的灵敏度和特异度分别是52.6%和99.2%;检测卷曲霉素耐药性的灵敏度和特异度分别是58.1%和97.7%;检测乙胺丁醇耐药性的灵敏度和特异度分别是69.8%和93.3%;检测XDR TB的灵敏度和特异度分别是56.1%和100%。基因型MTBDRsl分子线性探针法和传统的表型耐药方法检测LFX、AMK、CAP、EMB和XDR TB的一致性分别是85.4%、88.1%、90.0%,83.6%和88.3%,Kappa值分别是0.70,0.61,0.64,0.65和0.65.2.基因型MTBDRsl分子线性探针法得到检测报告的平均时间为3天(范围:1~6天),以培养为基础的传统药敏方法得到检测报告的平均时间为85天(范围:65~105天),诊断周期缩短了96%。3.在98株LFX表型耐药标本中,基因型MTBDRsl分子线性探针法确诊了80株,突变率最高的是gyr A-ΔWT3,MUT 3C/D94G(36/80,45%),其次为gyr A-ΔWT3,MUT 3B/D94Y(11/80,13.75%)、gyr A-MUT1/A90V+3C/D94G(9/80,11.25%)、gyr A-MUT3B/D94N+3C/D94G(8/80,10.0%)、gyr A-MUT3C(5/80,6.25%)、gyr A-ΔWT2,MUT1(3/80,3.75%)、gyr A-ΔWT3,MUT3A(2/80,2.50%)、gyr A-ΔWT2,MUT2(1/80,1.25%)和gyr A-ΔWT2,MUT1+3A(1/80,1.25%),其余4(5%)株标本未显示突变型条带但伴有野生型条带的消失;在基因型MTBDRsl分子线性探针法同时确诊的20株AG/CP表型耐药标本中,突变率最高的为rrs MUT 1/A1401G(15/20,75.0%),其次为rrs MUT 2/G1484T(3/20,15.0%)和rrs MUT 1/A1401G以及MUT2/G1484T(1/20,4.8%),其余1(4.8%)株标本未显示突变型条带但伴有野生型条带的消失;在63株EMB表型耐药标本中,基因型MTBDRsl分子线性探针法确诊了44株,突变率最高的为emb B MUT 1B/M306V(26/44,59.09%),其次为emb B MUT 1A/M3061(6/44(13.64%),其余12(27.27%)株标本未显示突变型条带但伴有野生型条带的消失。4.基因测序显示了部分检测结果不一致的标本的基因突变情况。在23株左氧氟沙星耐药性检测结果不一致的标本中,9株临床分离株发生了gyr A基因突变,2株发生了gyr B基因突变。其中4株为表型敏感Genotype MTBDRsl耐药,7株为表型耐药Genotype MTBDRsl敏感;在25株乙胺丁醇耐药性检测结果不一致的标本中,8株临床分离株发生了emb B基因突变。其中5株为表型敏感Genotype MTBDRsl耐药,3株为为表型耐药Genotype MTBDRsl敏感;在19株阿米卡星和16株卷曲霉素耐药性检测结果不一致的标本中,分别有3株和6株临床分离株发生了rrs基因突变,但是未发现tly A基因突变。其中1株为阿米卡星表型敏感Genotype MTBDRsl耐药,2株为阿米卡星表型耐药Genotype MTBDRsl敏感;3株为卷曲霉素表型敏感Genotype MTBDRsl耐药,3株为卷曲霉素表型耐药Genotype MTBDRsl敏感。结论:本研究提供了耐药结核病高发的医院在联合应用基因型MTBDRsl和基因型MTBDRplus分子线性探针法诊断广泛耐药结核病的重要数据。基因型MTBDRsl分子线性直接使用痰标本能快速筛查XDR TB。然而,基因型MTBDRsl分子线性探针法也存在明显缺陷,如灵敏度低,极大地限制了其临床应用价值。为了提高基因型MTBDRsl分子线性探针法检测XDR TB的灵敏度,应该纳入和分析更多与二线抗结核药物耐药性相关的基因突变。
【关键词】：基因分子线性探针法 药物敏感试验 基因测序 二线药物 基因突变
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中英文缩略词对照表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 第一章 前言17-21
• 第二章 材料和方法21-41
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 标本来源21
• 2.1.2 主要仪器设备21-22
• 2.1.3 主要试剂22-23
• 2.2 实验原理及前准备23-26
• 2.2.1 实验原理23
• 2.2.2 痰标本前处理23
• 2.2.3 直接痰涂片和萋-尼抗酸染色23-24
• 2.2.4 接种24-25
• 2.2.5 改良罗氏培养基25-26
• 2.2.6 液体MGIT960培养26
• 2.2.7 药敏试验临界浓度(ug/ml)26
• 2.3 GenoType MTBDRsl LPA操作步骤26-33
• 2.3.1 DNA提取26-27
• 2.3.2 PCR扩增27-28
• 2.3.3 反向杂交28-29
• 2.3.4 结果判读29-33
• 2.4 DNA测序33-39
• 2.4.1 测序引物合成33-34
• 2.4.2 测序菌株的筛选34
• 2.4.3 DNA提取34
• 2.4.4 PCR反应体系的建立34-35
• 2.4.5 PCR产物凝胶电泳成像35-38
• 2.4.6 扩增产物的回收与纯化38
• 2.4.7 耐药DNA测序38-39
• 2.5 技术路线图39
• 2.6 统计学方法39-41
• 第三章 结果41-49
• 3.1 一般情况41-43
• 3.2 GenotypeMTBDRsl分子线性探针法诊断准确性43-44
• 3.3 GenotypeMTBDRsl分子线性探针法诊断周期44
• 3.4 GenotypeMTBDRsl分子线性探针法诊断基因突变44-46
• 3.5 基因测序结果46-49
• 第四章 讨论49-54
• 第五章 结论54-55
• 第六章 创新性55-56
• 第七章 局限性与进一步研究方向56-57
• 7.1 局限性56
• 7.2 进一步研究方向56-57
• 参考文献57-65
• 综述65-74
• 参考文献72-74
• 发表论文情况74-75
• 致谢75-76
• 个人简历76-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 初乃惠;;应重视耐药结核病的规范化诊治[J];中国临床医生;2013年03期

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本文编号：969285