雷帕霉素对转基因绒山羊细胞中外源基因表达的影响

发布时间：2017-10-05 07:05

  本文关键词：雷帕霉素对转基因绒山羊细胞中外源基因表达的影响

  更多相关文章： 雷帕霉素 mTORC1 转基因细胞系 Keratin5启动子 IGF-1

【摘要】：雷帕霉素(rapamycin),又称西莫罗斯,属大环内酯类抗生素,在南太平洋复活节岛(Easter Island, Rapa Nui)的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus AY B-994)代谢产物中获得,起初被作为抗真菌药物使用,后发现其具有强烈的免疫抑制作用而被用于治疗器官移植的排斥反应。mTOR (mammalian target of rapamycin)是雷帕霉素在哺乳动物中的靶蛋白,以nTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)和mTORC2(mammalian target of rapamycin complex 2)两种蛋白质复合体的形式存在,其中mTORCl对雷帕霉素敏感,而nTORC2对其不敏感,雷帕霉素是rnTORC1的特异性抑制剂。mTOC1通过下游效应蛋白4E-BP1和S6K1调控细胞内蛋白质合成,也参与基因转录水平的调控。尽管对于mTOR信号通路功能的研究已较为深刻,但其对转基因细胞系中外源基因表达的作用尚无报道。本实验首先利用PCR技术克隆了人Keratin5启动子,并通过构建启动子功能验证载体pK5-DsRed2-1,转染绒山羊细胞,验证人Keratin5启动子的功能；其次,通过克隆绒山羊IGF-1基因,并连接到人Keratin5启动子下游,构建皮肤特异性表达载体pCDsRed-KI,转染细胞,构建转基因细胞系；最后,利用雷帕霉素处理转基因细胞,RT-PCR检测外源基因表达。结果显示：1)人Keratin5启动子在绒山羊细胞中驱动标记基因表达并具有皮肤特异性；2)pCDsRed-KI在皮肤成纤维细胞中成功表达,通过筛选获得了转基因细胞系；3)用雷帕霉素处理转基因细胞,可以抑制外源基因IGF-1得转录。上述结果表明mTOR信号通路对转基因细胞中外源基因的表达可能具有调控作用。
【关键词】：雷帕霉素 mTORC1 转基因细胞系 Keratin5启动子 IGF-1
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 缩略词表9-10
• 第一章 文献综述10-20
• 1. 雷帕霉素与吸水链霉菌10
• 2. mTOR和mTOR信号通路10-13
• 3. 角蛋白及K5启动子13-14
• 4. 胰岛样生长因子-1(IGF-1)14-16
• 参考文献16-20
• 第二章 皮肤特异性人表皮角蛋白5基因启动子克隆及表达载体构建20-32
• 1. 材料与方法20-27
• 1.1 材料20-21
• 1.2 人Keratin 5启动子的克隆21-24
• 1.3 构建pK5-DsRed2-1载体并验证Keratin 5启动子的皮肤特异性表达特性24-27
• 2. 结果27-30
• 2.1 人Keratin5启动子的克隆27-28
• 2.2 人Keratin5启动子在内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞中特异性表达28-30
• 3. 讨论30-31
• 参考文献31-32
• 第三章 皮肤特异性表达IGF-1载体构建并稳定转染绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞32-42
• 1. 材料与方法32-36
• 1.1 质粒、细胞系和菌株32
• 1.2 主要试剂及试验材料32-33
• 1.3 内蒙古绒山羊皮肤特异性表达IGF-1载体的构建33-35
• 1.4 表达载体pCDsRed2-KI转染内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞与胎儿成纤维细胞35-36
• 2. 结果36-41
• 2.1 皮肤特异性表达IGF-1载体的构建36-39
• 2.2 表达载体pCDsRed-KI稳定转染内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞与胎儿成纤维细胞39-41
• 3. 讨论41
• 参考文献41-42
• 第四章 雷帕霉素对转基因绒山羊细胞中外源基因表达的影响42-46
• 1. 材料与方法42-43
• 1.1 材料与试剂42
• 1.2 方法42-43
• 2. 结果43-45
• 3. 讨论45
• 参考文献45-46
• 结论46-47
• 附件47-48
• 致谢48-49
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文49

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