异烟肼诱导家蚕脂肪体损伤及其转录组学分析

发布时间：2017-10-08 00:27

  本文关键词：异烟肼诱导家蚕脂肪体损伤及其转录组学分析

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【摘要】：结核病是危害人类健康的三大疾病之一,由于其高发性和高死亡性,成为一个全球性的公共卫生问题。异烟肼(INH)是治疗结核病的首选药物,然而长期和大量服用INH的患者会出现不同程度的肝损伤。为了深入探讨INH类药物的肝毒性机制,本文采用经口暴露的方式,建立了INH对无脊椎动物家蚕脂肪体组织损伤模型,利用RNA-Seq技术比较分析了该模型基因的转录水平变化,探讨了对脂肪体代谢和功能的潜在影响。1 INH引起家蚕脂肪体出现类似哺乳动物肝毒性的损伤5龄第3 d的家蚕大造,经口暴露INH(1000 mg/kg)后15min,高效液相色谱HPLC即可检测到INH原药在血淋巴、中肠和脂肪体的存在,组织间原药的累积符合家蚕开放式循环系统特点。超氧化物歧化物(ROS)检测发现,INH处理组脂肪体和血淋巴中ROS水平明显高于水处理对照组;HE和DAPI组织切片染色鉴定结果显示,INH处理组脂肪体细胞中出现大量空泡,周围存在很多破碎的细胞和受损的细胞核。随着INH剂量的增加和处理后时间延长,家蚕血淋巴中与哺乳动物肝损伤相关的指标性酶活性丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性显著升高。表明家蚕在INH的作用下出现的脂肪体损伤与INH诱导哺乳动物的急性肝损伤具有相似性。2 INH诱导家蚕脂肪体细胞的基因转录水平改变经口暴露1000 mg/kg(溶液体积100μL)INH后8 h,成功构建两个INH/CK家蚕脂肪体组织的RNA-Seq文库,共获得了10113功能基因,其中差异性表达基因2211,包括1908仅在处理组或对照组特异性表达的基因,还有303个基因表达水平在处理组与对照之间显著性差异。其中INH处理后出现表达的特异性表达基因652个,沉默的基因高达1264个,上调表达的基因85个,还有218个基因下调了表达水平。3 INH转录组文库中差异表达基因的GO功能和KEGG通路分析INH/CK两个文库相比,特异表达基因和差异表达基因的GO功能:生物过程(Biological Process)在三个GO功能分布中差异基因最多,主要存在与生物调节、细胞过程、定位、代谢过程、色素沉着等GO分支中;分子功能(Moleclur Function)中连接(binding)和催化(catalytic)两个GO分支中差异基因占到该部分的差基因总数的90%;细胞成分(Cellular Component)中与细胞或生物膜有关的GO过程中也含有较多的差异基因。根据药物代谢特点,将差异表达基因所有的KEGG通路总结为10大通路,其中在核损伤通路(46个)、细胞外信号通路(31个)、蛋白代谢通路(27个)、细胞过程(52个)凋亡通路(29个)等都含有较多的差异表达基因。在INH的药物代谢KEGG通路中CYP4E3和GST的基因表达量发生变化,雌蚕和雄蚕脂肪体中GST活性显著下调。与细胞凋亡有关通路:内质网蛋白合成的信号通路中与蛋白质转运和结构、糖基化修饰有关的基因发生了显著性差异表达,线粒体能量代谢通路中细胞色素C和AMPK基因也发生显著性差异表达。INH影响线粒体呼吸链中复合物酶活性变化具有显著地时间和剂量效应。家蚕脂肪体中自噬基因Atg6和Atg8的表达量没有上调表达。
【关键词】：异烟肼 脂肪体损伤 差异表达基因 GO功能 KEGG通路
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-27
• 1 结核病研究现状12-13
• 2 主治药物异烟肼的研究进展13-14
• 3 药物性肝损伤14-16
• 3.1 药物性肝损伤机制14-15
• 3.2 肝损伤的酶指标15-16
• 4 INH造成肝损伤的机制研究现状16-22
• 4.1 INH抑制细胞内的抗氧化反应16
• 4.2 INH诱导肝细胞死亡的两大方式16-17
• 4.3 胞外凋亡信号通路： NF-kB17-19
• 4.4 胞内细胞凋亡通路：线粒体调节的凋亡通路19-22
• 5 药物肝毒性替代动物研究进展22-24
• 5.1 肝损伤动物模型及其替代研究发展趋势22-23
• 5.2 以家蚕为模式动物的研究23
• 5.3 家蚕脂肪体与哺乳动物肝脏功能比较23-24
• 6 转录组测序技术以及在毒理方面研究应用24-27
• 6.1 转录组学测序技术的发展24-25
• 6.2 高通量测序技术有关毒理学研究的应用25-27
• 第二章 研究内容与方法27-38
• 1 研究目的和意义27
• 2 研究内容27-28
• 3 技术路线28
• 4 试验动物28-29
• 4.1 家蚕饲养方法28-29
• 4.2 供试实验动物的处理29
• 4.3 家蚕给药方式29
• 5 主要试剂29-30
• 6 主要仪器30-31
• 7 试验方法31-38
• 7.1 高效液相色谱(HPLC)检测INH条件31-32
• 7.2 家蚕脂肪体肝损伤指标测定32
• 7.3 总RNA的抽提与反转录32-34
• 7.4 实时定量PCR（qRT-PCR）34-35
• 7.5 石蜡组织切片制备35-36
• 7.6 活性氧（ROS）检测36
• 7.7 DAPI染色36-37
• 7.8 数字基因表达谱文库构建和测序数据分析37-38
• 第三章 结果与分析38-60
• 1 HPLC检测INH经口暴露后，在家蚕各组织中的分布38
• 2 INH经口暴露诱导家蚕各组织活性氧水平提高38-39
• 3 INH对家蚕脂肪体组织造成的损伤39-40
• 4 肝损伤有关的酶活指标的测定40-41
• 5 INH诱导家蚕脂肪体的转录组学文库信息分析41-43
• 5.1 INH/CK两个文库质量分析41-42
• 5.2 Clean reads注释到NCBI的基因物种分布情况42-43
• 6 INH诱导家蚕脂肪体表达基因差异性分析43-48
• 6.1 INH/CK两个DGE文库中所有基因表达分析和Venn图43-44
• 6.2 INH/CK两个DGE文库中特异性基因的GO功能分析44-46
• 6.3 INH/CK两个DGE文库中显著性差异表达基因的GO功能分析46-47
• 6.4 INH/CK的差异表达基因的GO功能的量化分析47-48
• 7 差异表达基因的KEGG通路分析48-57
• 7.1 归类统计差异基因的KEGG通路48-51
• 7.2 基于DGE文库筛选INH在家蚕脂肪体的药物代谢通路51-52
• 7.3 基于DGE文库筛选INH诱导家蚕脂肪体损伤的的信号通路52-57
• 8 差异基因的QRT-PCR验证57-58
• 9 讨论58-60
• 第四章 结论与展望60-62
• 1 综合结论60-61
• 1.1 INH作用下家蚕脂肪体发生类似哺乳动物肝损伤的组织损伤60
• 1.2 INH干扰家蚕脂肪体基因的转录表达水平60
• 1.3 INH作用下内质网应激通路和线粒体能量代谢通路调节细胞凋亡60-61
• 2 后续研究展望与建议61-62
• 参考文献62-75
• 附录75-76
• 发表论文与参与项目76-78
• 致谢78-80

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本文编号：990976