维拉帕米抗小鼠急性肝衰竭作用及其机制研究

发布时间：2017-10-08 13:25

  本文关键词：维拉帕米抗小鼠急性肝衰竭作用及其机制研究

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【摘要】：目的观察维拉帕米(Verapamil, VER)抗小鼠急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)作用,研究VER对ALF小鼠肝功能及血流动力学的影响,并初步探讨其作用机制。方法1.采用D-氨基半乳糖(D-GlaN)与脂多糖(LPS)联合给药诱导小鼠ALF。造模前1h尾静脉注射VER,观察VER对ALF小鼠存活率,血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)含量等肝功能指标的影响,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)氧化指标活性的变化以及HE染色观察肝组织病理学改变,评价VER抗小鼠ALF作用。2.通过酶联免疫吸附法(ELISA)动态观察VER对ALF小鼠造模后1、2、4、6hTNF-α含量和组织蛋白酶B(Cath B)活性的影响；实时荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2基因水平的表达,研究VER抗小鼠ALF的分子作用机制。3.观察ALF小鼠平均动脉压、心率的变化,以及肝组织血流量、血流速度的改变,研究VER对ALF小鼠血流动力学的影响,评价VER的不良反应。结果l.D-GlaN/LPS成功诱导小鼠ALF。造模前1h静脉注射VER可非常显著地提高小鼠存活率,降低ALT、AST、TBIL水平,改善肝功能。并且降低ALF小鼠MDA水平,升高SOD活性,发挥抗氧化损伤作用。同时肝组织切片发现VER能大大减轻肝组织病理变化,维持肝组织和细胞正常结构,防止肝组织坏死。2. ELISA结果表明注射D-GlaN和LPS后1h,ALF小鼠TNF-α含量急剧升高,Cath B活性在4h时达到峰值,给予VER能下调TNF-α含量和Cath B活性。实时荧光定量PCR结果表明ALF小鼠Bax基因水平表达量增加,给予VER治疗可下调Bax基因水平,上调Bcl-2基因水平,降低Bax/Bcl-2比值,发挥抗凋亡作用。3.ALF小鼠平均动脉压下降,心率加快,肝脏血流量减少,血流速度减慢,说明发生肝功能衰竭时,肝脏微循环出现明显障碍。而VER治疗能增加肝脏血流量,改善肝脏微循环,但是大剂量VER能明显降低血压和心率,会导致严重低血压、心动过缓不良反应。结论VER具有极为显著的抗D-GlaN和LPS诱导的小鼠ALF作用,抑制肝细胞死亡,减轻肝组织病理改变。该药可能通过消除钙超载、抗氧化损伤、抑制TNF-α死亡受体通路和溶酶体Cath B介导的死亡通路,以及阻止Bax基因、促进Bcl-2基因上调,抑制线粒体凋亡通路激活而发挥抗凋亡作用。但是由于大剂量会降低血压和心率,会导致严重低血压、心动过缓不良反应,后期研究需对剂量或剂型作进一步的改善。
【关键词】：维拉帕米 凋亡 坏死 急性肝衰竭
【学位授予单位】：浙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 缩略词6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-13
• 第一部分 维拉帕米抗ALF小鼠药效学研究13-21
• 一、实验材料与方法13-15
• (一) 实验材料13-14
• 1. 实验药品与试剂13
• 2. 实验仪器13
• 3. 实验动物13-14
• (二) 实验方法14-15
• 1. 小鼠ALF模型的建立14
• 2. VER对ALF小鼠存活率的影响14
• 3. VER对ALF小鼠肝功能水平的影响14
• 4 VER对ALF小鼠肝组织病理学改变的影响14-15
• 5 统计处理15
• 二 实验结果15-19
• 1. 小鼠ALF模型的建立15-16
• 2. VER对ALF小鼠存活率的影响16
• 3. VER对ALF小鼠肝功能的影响16-18
• 4. VER减轻ALF小鼠肝组织病理改变18-19
• 三 讨论19
• 四 小结19-21
• 第二部分 维拉帕米抗ALF小鼠肝细胞死亡作用的分子机制探讨21-33
• 一、实验材料与方法21-26
• (一) 实验材料21-22
• 1. 实验药品与试剂21
• 2. 实验仪器21
• 3. 实验动物21-22
• (二) 实验方法22-26
• 1. 实验分组22
• 2. 小鼠血清以及组织样本的采集22
• 3. VER对ALF小鼠血清TNF-α含量的影响22-23
• 4. VER对ALF小鼠肝组织匀浆组织蛋白酶B(Cath B)活性的影响23
• 5. RT-PCR法检测Bax、Bcl-2基因表达水平23-26
• 5.1. 实验中主要器具处理及试剂配制24
• 5.2. 肝组织样本总RNA的提取24-25
• 5.3. 反转录合成cDNA25
• 5.4. 荧光定量PCR检测引物设计和扩增条件优化25-26
• 5.5. 数据收集26
• 6. 统计处理26
• 二 实验结果26-31
• 1. VER对ALF小鼠血清TNF-α含量的影响26-27
• 2. VER对肝组织匀浆Cath B活性的影响27-28
• 3. 实时荧光定量PCR检测VER对ALF小鼠肝脏Bax、Bcl-2基因表达的影响28-31
• 3.1. 扩增产物特异性28-29
• 3.2. Bax、Bcl-2基因扩增效率29-30
• 3.3. VER对Bax、Bcl-2基因表达的影响30-31
• 三 讨论31-32
• 四 小结32-33
• 第三部分 维拉帕米对ALF小鼠血流的影响33-39
• 一、实验材料与方法33-34
• (一) 实验材料33
• 1. 实验药品与试剂33
• 2. 实验仪器33
• 3. 实验动物33
• (二) 实验方法33-34
• 1. 实验动物分组及给药方法33-34
• 2. VER对ALF小鼠平均动脉压、心率的影响34
• 3. VER对ALF小鼠血流量的影响34
• 4. 统计处理34
• 二 实验结果34-37
• 1. VER对ALF小鼠血压、心率的影响34-36
• 1.1. VER对ALF小鼠血压的影响34-35
• 1.2. VER对ALF小鼠心率的影响35-36
• 2. VER对ALF小鼠肝脏血流量的影响36-37
• 2.1. VER对ALF小鼠肝脏血流量的影响36
• 2.2. VER对ALF小鼠肝脏血流速度的影响36-37
• 三 讨论37
• 四 小结37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-42
• 致谢42-43
• 文献综述43-55
• 参考文献52-55

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