煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传学改变

发布时间：2017-10-10 20:11

  本文关键词：煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传学改变

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【摘要】：目的 表观遗传学是不涉及DNA序列改变却可以调控基因表达水平和功能的可遗传的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控；且表观遗传学的异常改变常发生于肿瘤形成的早期。为此，本课题以处理后煤焦沥青烟提取物(coar tar pitch extracts，CTPE)为测试物，体外构建人支气管上皮细胞(humanbronchial epithelial cells, BEAS-2B)恶性转化模型，确认细胞恶变前提下，动态检测不同时期细胞表观遗传学变化包括基因组DNA甲基化水平；DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferase3a，DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase3b，DNMT3b)、组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase enzyme HDAC1）mRNA及蛋白表达水平；miR-21和miRlet-7a表达水平，探讨CTPE致细胞恶变过程中尤其是癌前病变中表观遗传学分子标志改变，为肺癌早期诊断、高发风险估计的提供更多高效标志。 方法 据前期确定染毒剂量分为B(a)P阳性对照组、DMSO阴性对照组、煤焦沥青烟提取物染毒组（CTPE组）建立BEAS-2B细胞恶性转化模型。高效液相色谱法检测细胞基因组甲基化水平；Real-Time PCR检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1mRNA表达量及miR-21、miRlet-7a表达量；酶联免疫吸附法(ELISA)检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HADC1蛋白含量。 结果 1.基因组DNA甲基化水平：第10代各组细胞基因组DNA整体甲基化率差异均无统计学意义（P=0.069）；20代时B(a)P组、CTPE组甲基化率均低于DMSO组，差异均有统计学意义（P0.001；P0.001），B(a)P低于CTPE组差异有统计学意义（P=0.042）；30代时甲基化率进一步降低，3组差异有统计学意义（P=0.003），B(a)P组与CTPE组相比，差异无统计学意义（P=0.322）。 2. DNMTs基因和蛋白表达情况：随传代次数增加，DMSO组DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA、蛋白表达量差异无统计学意义（均P0.05）；而DNMT1mRNA及其蛋白在B(a)P组、CTPE组表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（均P0.05）。DNMT3a在B(a)P组和CTPE组mRNA及其蛋白表达量均逐渐增加，差异均有统计学意义（均P0.05）。DNMT3b mRNA和蛋白在B(a)P组和CTPE组的表达量逐渐增加，B(a)P组mRNA及其蛋白差异有统计学意义（P=0.005；P0.001），CTPE组mRNA无统计学意义(P=0.131)，蛋白差异有统计学意义（P0.001)。 3. HDAC1基因和蛋白表达情况：随传代次数增加，HDAC1mRNA及其蛋白在B(a)P组和CTPE组表达量均逐渐增加，差异均有统计学意义（均P0.05），DMSO组表达量差异无统计学意义（P=0.997；P=0.326）。 4. miRlet-7a和miR-21基因相对表达量：随传代次数增加，miRlet-7a在B(a)P组和CTPE组的表达量均逐渐增加，差异有统计学意义（P=0.013；P=0.002)，，DMSO组表达量差异无统计学意义（P=0.996）。miR-21基因相对表达量随传代次数增加，B(a)P组和CTPE组的表达均逐渐增加，差异均有统计学意义（P=0.012；P=0.034），DMSO组表达差异无统计学意义（P=0.999）。 结论 1. CTPE诱导BEAS-2B细胞恶变过程与基因组DNA低甲基化，DNMTs、HDAC1、miR-21、miRlet-7a高表达有关，且通过它们之间的协同作用调节基因的表达，导致细胞发生恶变。 2. CTPE致BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传学分子可作为肺癌早期诊断及危险度评价的有效生物标志。
【关键词】：煤焦沥青烟提取物 BEAS-2B细胞 表观遗传学 DNA甲基化HDAC miR-21 miRlet-7a
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 图表索引11-12
• 英文缩略词表12-13
• 1 引言13-15
• 2 材料与方法15-28
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 实验对象与受试物15
• 2.1.2 主要实验试剂15-16
• 2.1.3 主要实验仪器16-17
• 2.1.4 主要试剂配制17-18
• 2.1.4.1 BEAS-2B 细胞培养所需溶液的配制17
• 2.1.4.2 基因组 DNA 甲基化所需试剂的配制17-18
• 2.1.4.3 Real-time PCR 所需试剂配制18
• 2.1.4.4 ELISA 所需试剂配制18
• 2.2 实验方法18-28
• 2.2.1 细胞培养18-19
• 2.2.2 细胞染毒及恶性转化细胞株的建立19
• 2.2.3 细胞基因组甲基化水平检测19-22
• 2.2.3.1 细胞内总 DNA 的提取19-20
• 2.2.3.2 基因组 DNA 水解预处理20-21
• 2.2.3.3 标准溶液的配制21
• 2.2.3.4 标准方程的建立21
• 2.2.3.5 高效液相色谱法检测样品21-22
• 2.2.4 Realtime-PCR 分析22-26
• 2.2.4.1 细胞总 RNA（Small RNA）提取及纯度、完整性22-23
• 2.2.4.2 细胞总 RNA（small RNA）逆转录23-25
• 2.2.4.2.1 细胞总 RNA 逆转录23
• 2.2.4.2.2 Small RNA 逆转录23-25
• 2.2.4.3 Real-time PCR 引物的设计与合成25
• 2.2.4.4 PCR 反应体系25-26
• 2.2.4.5 PCR 反应条件26
• 2.2.4.6 Real-time PCR 结果分析26
• 2.2.5 ELISA 检测 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1 在细胞培养上清中的表达26-27
• 2.2.6 统计分析27-28
• 3 结果28-41
• 3.1 各组细胞基因组 DNA 甲基化水平的检测28-30
• 3.1.1 基因组提取 DNA 的完整性、纯度及浓度的检测28
• 3.1.2 高效液相色谱法测定脱氧核苷标准品分析结果28-30
• 3.2 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1 mRNA 水平的表达30-34
• 3.2.1 细胞提取 RNA 的完整性、纯度及浓度的检测30-34
• 3.3 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1 蛋白水平的表达34-37
• 3.4 miRlet-7a 和 miR-21 水平的表达37-39
• 3.5 CTPE 组第 10 代、20 代、30 代细胞 DNA 甲基化率、DNMT1、-3a、-3b、HDAC1 mRNA 、miRlet-7a、miR-21 基因相对表达量相关性分析39-41
• 4 讨论41-45
• 4.1 CTPE 刺激对基因组 DNA 甲基化率的影响41-42
• 4.2 CTPE 刺激对 DNMTs 表达的影响42-43
• 4.3 CTPE 刺激对 HDAC1 表达的影响43
• 4.4 CTPE 刺激对 miRlet-7a 和 mi-21 表达水平的影响43-44
• 4.5 DNA 甲基化率、DNMT1、-3a、-3b、HDAC1、miRlet-7a、miR-21 基因相对表达量相关性分析44-45
• 5 结论45-46
• 6 参考文献46-49
• 综述49-68
• 参考文献62-68
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果68-69
• 致谢69

【参考文献】

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1 李智涛;煤焦沥青烟提取物致支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究[D];郑州大学;2010年

本文编号：1008356