丙烯酰胺诱导的神经丝改变的干预机制

发布时间：2017-10-20 16:20

  本文关键词：丙烯酰胺诱导的神经丝改变的干预机制

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【摘要】：目的丙烯酰胺(acrylamide, ACR)作为一种乙烯基单体,是生产聚丙烯酰胺的原料；聚丙烯酰胺在工业上应用十分广泛。目前已知ACR具有多种毒性,如致癌性、遗传毒性、神经毒性、生殖毒性等。近年来,ACR的神经毒性备受关注。职业暴露于ACR的神经毒作用的主要临床表现为共济失调、骨骼肌肉无力、认知障碍、四肢麻木；在电镜下ACR中毒的主要病理表现为肿胀的轴突末端神经丝(neurofilaments, NFs)堆积。钙蛋白酶(calpain)作为一类依赖钙离子(Ca2+)激活的中性半胱氨酸水解酶,具有降解NFs的作用,在ACR诱导的神经病变中发挥重要作用。因此,本实验通过建立大鼠ACR亚慢性中毒及钙蛋白酶抑制剂calpeptin(CP)干预模型,观察大鼠行为学指标变化,检测神经元细胞内Ca2+浓度及calpain活性、NFs含量在中枢神经系统及周围神经系统中的变化,探讨ACR诱导的NFs改变的干预机制。方法1.将36只无特定病原体级的成年健康Wistar雌性大鼠随机分为4组,每组各9只。A组为空白对照组,给予生理盐水腹腔注射(intraperitoneal injection, i.p.); B组为CP对照组,给予200μg/kg CP (i.p.); C组为ACR中毒模型组,给予30mg/kg ACR (i.p.); D组为CP干预模型组,在给予大鼠30mg/kg ACR 1h后,给予200μg/kg CP(i.p.)干预。每周隔天给予ACR染毒,3次／周,连续4周；每周隔天给予CP干预,早晚各一次,6次／周,连续四周。2.染毒期间,每周进行一次体重的测量及步态评分、后肢撑力指标的测定。(1)步态评分：观察大鼠的自由活动情况,并根据其步态受损程度进行赋分,分别为1-4分。1分为正常步态、2分为轻度异常步态、3分为中度异常步态、4分为重度异常步态。每只大鼠观测3次,取平均值。(2)后肢撑力：将大鼠从距离着陆的水平地面30cm高处自由水平落下,测量双后肢爪尖滑开的最远距离,记为后肢撑力指数,单位为cm。每只大鼠测量3次,取平均值。3.染毒结束后第二日处死大鼠,提取大脑及坐骨神经组织。制备大脑细胞悬液,使用台盼蓝排斥试验检查细胞的成活率。使用钙离子荧光探针(Flua-2/AM)负载,测定细胞悬液荧光强度,计算Ca2+浓度。4.将大脑、坐骨神经组织进行匀浆、离心提取上清液并进行蛋白定量,使用具有荧光特性的calpain substrate Ⅱ结合calpain,以7-氨基-4-甲基香豆素为标准荧光物质,测定荧光强度,计算calpain活性。5.应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法,对大脑、坐骨神经组织中NFs含量进行半定量分析。结果1.大鼠体重的改变染毒终点,与空白对照组相比,CP对照组无显著变化(P0.05), ACR中毒模型组大鼠体重降低了11.3%(P0.01),而CP干预模型组无显著变化(P0.05)；与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组大鼠体重升高了8.3%(P0.01)。2.大鼠步态评分、后肢撑力的改变(1)步态评分：染毒终点,与空白对照组相比,CP对照组无显著差异(P0.05), ACR中毒模型组及CP干预模型组大鼠步态评分分别升高了167%(P0.01)、100%(P0.01)；与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组大鼠步态评分降低了25.1%(P0.01)。(2)后肢撑力：染毒终点,与空白对照组相比,CP对照组无显著差异(P0.05), ACR中毒模型组及CP干预模型组大鼠后肢撑力指数分别升高了76.7%(P0.01)、49.5%(P0.01)；与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组大鼠后肢撑力指数降低了15.4%(P0.01)。3.大脑组织细胞内Ca2+浓度的改变与空白对照组相比,CP对照组Ca2+浓度无显著变化(P0.05); ACR中毒模型组Ca2+浓度显著升高了44.6%(P0.01)；CP干预模型组Ca2+浓度有所升高,但无统计学意义(P0.05)。与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组Ca2+浓度显著降低了22.6%(P0.01)。4.大脑、坐骨神经组织内calpain活性的改变(1)大脑calpain活性的改变与空白对照组相比,CP对照组calpain活性显著降低了14.3%(P0.01)；ACR中毒模型组及CP干预模型组大鼠calpain活性分别升高了21.9%(P0.01)、11.5%(P0.01)。与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组calpain活性显著降低了8.5%(P0.01)。(2)坐骨神经calpain活性的改变与空白对照组相比,CP对照组无显著差异(P0.05), ACR中毒模型组及CP干预模型组大鼠calpain活性分别升高了27.6%(P0.01)、11.7%(P0.01)；与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组大鼠calpain活性降低了12.4%(P0.01)。5.大脑、坐骨神经组织内NFs含量的改变(1)大脑组织内NFs含量的变化与空白对照组相比,CP对照组NFs三个亚基低分子量神经丝(light neurofilament, NF-L)、中分子量神经丝(medium neurofilament, NF-M)、高分子量神经丝(heavy neurofilament, NF-H)含量分别升高了2.3%、降低了0.8%、升高了0.3%,变化均无显著性差异(P0.05); ACR中毒模型组三个亚基分别升高了85.3%(P0.01)、74.3％(P0.01)、82.9％(P0.01); CP干预模型组三个亚基分别升高了32.4%(P0.01)、30.6%(P0.01)、32.3%(P0.01)；与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组三个亚基分别降低了28.5%(P0.01)、25.1%(P0.01)、27.7%(P0.01)。(2)坐骨神经组织内NFs含量的变化与空白对照组相比,CP对照组NF-L、NF-M、NF-H含量分别升高了14.3%(P0.05)、28.6％(P0.01)、10.1％(P0.05), ACR中毒模型组三个亚基分别降低了56.0%(P0.01)、55.5％(P0.01)、39.3％(P0.01), CP干预模型组三个亚基分别降低了25.6%(P0.01)、33.6%(P0.01)、16.9%(P0.05)；与ACR中毒模型组相比,CP干预模型组三个亚基分别升高了69.1%(P0.01)、49.2%(P0.01)、36.9%(P0.01)。结论1.成功建立了大鼠ACR亚慢性中毒及CP干预模型。2.CP能够逆转ACR所引起的Ca2+浓度升高、calpain活性升高的趋势；CP在大脑、坐骨神经组织内均可逆转ACR所致NFs的变化趋势。3.ACR可能是通过激活Ca2+-calpain-NFs通路导致其神经病。
【关键词】：丙烯酰胺 钙蛋白酶抑制剂 钙蛋白酶 神经丝 神经病
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符号说明14-16
• 前言16-22
• 材料和方法22-31
• 结果31-44
• 讨论44-53
• 结论53-54
• 参考文献54-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表的论文66-67
• 学位论文评阅及答辩情况表67

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本文编号：1068157