电离辐射对SIK2基因表达的调控作用研究

发布时间：2018-01-13 13:33

  本文关键词：电离辐射对SIK2基因表达的调控作用研究　出处：《南华大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： SIK2 电离辐射 蛋白表达 转录水平 细胞周期 启动子活性

【摘要】：目的： 从mRNA、蛋白水平和启动子活性研究电离辐射对SIK2基因表达的影响、作用规律和相关机制，并构建SIK2基因的真核表达载体，为深入探讨SIK2的生物学功能及其在细胞放射损伤反应中的作用提供信息和实验基础。 方法： 1.2、4和10Gy~(60)Coγ射线照射肝癌细胞HepG2后，实时定量PCR检测照射后0、2、4、6、10、12h时间点的SIK2mRNA表达的时间效应关系； 2.1、2、4、6、10Gy~(60)Coγ射线照射肝癌细胞HepG2后6h收集样品，实时定量PCR检测SIK2mRNA表达的剂量效应关系； 3.2Gy和10Gy照射后，免疫印迹检测SIK2蛋白随照后时间表达水平的变化；流式细胞术分析照射后HepG2细胞的周期变化； 4. TdR双阻断法同步化HepG2细胞，流式细胞术检测周期变化及实时定量PCR检测相应时间点的SIK2mRNA水平的变化； 5.构建SIK2启动子重组报告质粒，分析电离辐射诱导后启动子转录活性的变化； 6.利用DNA重组技术构建pCMV-Tag-2B-SIK2的真核表达质粒。 结果： 1.利用实时定量PCR技术对辐射诱导SIK2基因表达的时间效应和剂量效应进行分析，，结果表明射线照射对SIK2mRNA表达有诱导表达作用，但是与辐射剂量间没有明显的依赖关系（P0.05）；在时间效应方面，发现2Gy、4Gy和10Gy照射后10h时间点，SIK2mRNA表达水平增加具有显著性统计学意义（P 0.05）。 2. Western Blot结果表明，2Gy照射后SIK2蛋白随着照后时间的延伸而表达量增加；10Gy照射后表达变化趋势同2Gy一样，但增强的幅度相对较弱；1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy照射后，SIK2蛋白表达水平随剂量的增加而增加。 3.流式细胞术检测2Gy和10Gy辐照后HepG2细胞均在10h左右出现了G2/M期阻滞高峰(P0.05)，与辐照后SIK2mRNA出现高峰值的时间点吻合；利用胸腺嘧啶双阻断同步化HepG2细胞后，实时定量PCR方法检测SIK2mRNA随细胞周期进程的变化，结果显著变化不显著。由此明确了电离辐射诱发SIK2mRNA表达增加不是细胞周期的变化的伴随结果（P0.05）。 4.构建了SIK2基因启动子的重组质粒，通过双系统荧光报告基因活性分析，提示SIK2的启动子包含-2000~+119区域，可能还向上游继续延伸；另外，-2000~+119范围区间的启动子在辐射后10h的转录活性显著增加(P 0.05)。 5.构建了重组真核表达质粒pCMV-Tag-2B-SIK2质粒，通过顺转的方法鉴定质粒在293T细胞内成功表达，为SIK2后续功能和作用机制研究提供实验基础。 结论： 1.电离辐射对SIK2mRNA表达有诱导作用，但无明显的剂量依赖性。 2.~(60)Coγ射线诱导SIK2蛋白的表达水平增加，部分作用机制是照射后一定时间范围内SIK2启动子转录活性的增加，由此使mRNA转录增加，进一步加强了SIK2蛋白的表达水平。虽然SIK2参与细胞周期调节，但其mRNA在照射后期表达增加的原因与辐射诱导的G2/M期阻滞没有关系。
[Abstract]:Objective: The effects of ionizing radiation on the expression of SIK2 gene were studied from the mRNAs, protein levels and promoter activity. The eukaryotic expression vector of SIK2 gene was constructed. To provide information and experimental basis for the further study of biological function of SIK2 and its role in cell radiation injury response. Methods: The HepG2 of hepatoma cells was irradiated with 1.2c4 and 10Gy ~ (60) Co 纬 -rays, and the real-time quantitative PCR was used to detect the 10 ~ (-) ~ (-) ~ (-) ~ (-) ~ (-) after irradiation. The time-effect relationship of SIK2mRNA expression at 12h; The samples were collected 6 hours after irradiation with 纬 -ray on hepatoma cell line (HepG2). The dose-effect relationship of SIK2mRNA expression was detected by real-time quantitative PCR. The expression level of SIK2 protein was detected by Western blot after irradiation of 3.2 Gy and 10 Gy, and the changes of HepG2 cell cycle after irradiation were analyzed by flow cytometry. 4. TdR double blocking method was used to synchronize HepG2 cells, flow cytometry was used to detect the cycle change and real-time quantitative PCR was used to detect the changes of SIK2mRNA level at the corresponding time points. 5. Construct SIK2 promoter recombination report plasmid, analyze the change of promoter transcription activity after ionizing radiation. 6. The eukaryotic expression plasmid of pCMV-Tag-2B-SIK2 was constructed by DNA recombination technique. Results: 1. The time and dose effects of radiation-induced SIK2 gene expression were analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that radiation irradiation could induce the expression of SIK2mRNA. However, there was no obvious dependence on the dose of radiation. In terms of time effect, it was found that the expression level of SIK2 mRNA increased significantly at 10 h after 2 Gy and 10 Gy irradiation (P 0.05). 2. The results of Western Blot showed that the expression of SIK2 protein increased with the extension of irradiation time. After 10 Gy irradiation, the change trend of expression was the same as that of 2 Gy, but the amplitude of enhancement was relatively weak. The expression level of sik2 protein increased with the increase of dose after 1 Gy 2 Gy 2 Gy 4 Gy 4 Gy 6 Gy 10 Gy irradiation. 3. Flow cytometry was used to detect the peak of G _ 2 / M arrest in HepG2 cells at about 10 h after 2 Gy and 10 Gy irradiation (P0.05). It coincides with the time point of high peak value of SIK2mRNA after irradiation. After the synchronization of HepG2 cells was blocked by thymidine, the changes of SIK2mRNA with cell cycle were detected by real-time quantitative PCR. The results showed that the increase of SIK2mRNA expression induced by ionizing radiation was not associated with the change of cell cycle. 4. The recombinant plasmid of promoter of SIK2 gene was constructed. The results showed that the promoter of SIK2 contained -2000 ~ 119 region by double-system fluorescence reporter gene activity analysis. May also continue upstream; In addition, the transcriptional activity of the promoter in the range from 2000 to 119 increased significantly at 10 h after irradiation (P 0.05). 5. The recombinant eukaryotic expression plasmid pCMV-Tag-2B-SIK2 plasmid was constructed and successfully expressed in 293T cells. It provides the experimental basis for the study of the function and mechanism of SIK2. Conclusion: 1. Ionizing radiation induced the expression of SIK2mRNA, but there was no significant dose-dependent effect. 2. The level of SIK2 protein expression induced by 60Co 纬 -ray was increased, partly by the increase of transcriptional activity of SIK2 promoter within a certain time range after irradiation. As a result, mRNA transcription was increased and the expression of SIK2 protein was further enhanced, although SIK2 was involved in cell cycle regulation. However, there was no relationship between the increase of mRNA expression and the G _ 2 / M phase arrest induced by radiation.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

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本文编号：1419081