MAPK信号通路介导铝致PC12细胞程序性坏死中作用的研究

发布时间：2018-01-13 19:03

  本文关键词：MAPK信号通路介导铝致PC12细胞程序性坏死中作用的研究　出处：《山西医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:通过加入凋亡抑制剂(z-VAD-fmk)、坏死抑制剂(Nec-1)以及P38、JNK、ERK相应的抑制剂,探讨MAPK信号通路在麦芽酚铝PC12细胞程序性坏死中的作用。方法:1、细胞的培养及处理:(1)将PC12细胞在37℃、5%的CO2恒温培养箱中培养。(2)取处于对数生长期的适量PC12细胞,用麦芽酚铝(200μmol/L)对其进行染毒24 h,分别设置空白对照组、溶剂对照组(DMSO组)、凋亡抑制剂(z-VAD-fmk)组、坏死抑制剂(Nec-1)组、麦芽酚铝组,麦芽酚铝+z-VAD-fmk组、麦芽酚铝+Nec-1组。其中麦芽酚铝+z-VAD-fmk组和麦芽酚铝+Nec-1组在用染麦芽酚铝处理之前,先加入凋亡、坏死抑制剂z-VAD-fmk和Nec-1各作用1 h,其浓度分别为20μmol/L和60μmol/L。(3)取处于对数生长期的适量PC12细胞,用麦芽酚铝(200μmol/L)对其进行染毒24 h,在染毒处理前,分别加入P38、JNK和ERK相应的抑制剂(SB203580/SP600125/U0126)作用1h,其浓度分别为625 nmol/L、10μmol/L和15μmol/L。2、用CCK-8的方法测定各处理组的细胞活力,流式细胞仪检测细胞的凋亡率和坏死率,AO-EB法检测细胞的形态学变化,RT-PCR检测P38、JNK和ERK的基因表达情况,并用Western-blot方法检测P38、JNK、ERK、p-P38、p-JNK和p-ERK蛋白表达情况。结果:1、(1)AO-EB结果显示:空白对照组和DMSO溶剂对照组核染色质均着绿色并呈正常结构,与空白对照组比较,麦芽酚铝组核染色质着橘红色并呈正常结构或者呈固缩状或着片段状的细胞增多,即凋亡细胞和坏死细胞增多。与麦芽酚铝组比较,麦芽酚铝+zvad-fmk组的凋亡细胞减少,核染色质着橘红色并呈缩状的细胞减少,麦芽酚铝+nec-1组的坏死细胞减少,核染色质着橘红色并呈正常结构的细胞减少。(2)cck-8细胞活力测试:与空白对照组比较,麦芽酚铝组、麦芽酚铝+zvad-fmk组和麦芽酚铝+nec-1组的细胞活力均下降了36.91%、13.8%和18.94%,且差异有统计学意义(p0.05)。与麦芽酚铝组比较,麦芽酚铝+zvad-fmk组和麦芽酚铝+nec-1组的细胞活力均上升了23.11%和17.97%,且差异有统计学意义(p0.05)。(3)流式细胞仪测定:与空白对照组比较,zvad-fmk组、nec-1组、麦芽酚铝组、麦芽酚铝+zvad-fmk组和麦芽酚铝+nec-1组的坏死率和凋亡率均降低,且差异有统计学意义(p0.05);与麦芽酚铝比较,麦芽酚铝+zvad-fmk组和麦芽酚铝+nec-1组的凋亡率和坏死率均降低,且差异有统计学意义(p0.05)。(4)rt-pcr检测:不同处理组间p38、jnk、erk基因的相对表达量有略微的变化,但是差异无统计学意义(p0.05)。(5)western-blot结果:麦芽酚铝染毒pc12细胞后各组间p38、jnk、erk、p-jnk表达差异无统计学意义(p0.05),p-p38、p-erk表达差异有统计学意义(p0.05)。与正常对照组相比,al(mal)3组、al(mal)3+zvad-fmk组和al(mal)3+nec-1组的p-p38表达量增加,差异有统计学意义(p0.05),与al(mal)3组比较,al(mal)3+zvad-fmk组和al(mal)3+nec-1组的p-p38表达量均下降,差异有统计学意义(p0.05);与正常对照组相比,al(mal)3组、al(mal)3+zvad-fmk组和al(mal)3+nec-1组的p-erk的表达量下降,差异有统计学意义(p0.05),与al(mal)3组比较,al(mal)3+zvad-fmk组和al(mal)3+nec-1组的表达量p-erk均增加,差异有统计学意义(p0.05)。2、(1)ao-eb结果显示:与染麦芽酚铝组比较,麦芽酚铝+sb203580抑制剂组的核染色质着橘红色的细胞减少;麦芽酚铝+sp600125抑制剂组的核染色质颜色无明显变化;麦芽酚铝+u0126抑制剂组的核染色质着橘红色的细胞增多。(2)cck-8细胞活力测试:与空白对照组比较,麦芽酚铝组、麦芽酚铝+sb203580抑制剂组、麦芽酚铝+sp600125抑制剂组和麦芽酚铝+u0126抑制剂组的细胞活力均下降,且差异有统计学意义(p0.05);与染麦芽酚铝组比较,麦芽酚铝+sb203580抑制剂组的细胞活力上升,且差异有统计学意义(p0.05);麦芽酚铝+sp600125抑制剂组的细胞活力上升,但差异无统计学意义(p0.05);麦芽酚铝+u0126抑制剂组的细胞活力也下降,且差异有统计学意义(P0.05)。(3)流式细胞仪测定:与空白对照组比较,麦芽酚铝组、麦芽酚铝+SB203580抑制剂组、麦芽酚铝+SP600125抑制剂组和麦芽酚铝+U0126抑制剂组的凋亡率和坏死率均上升,且差异有统计学意义(P0.05)。与麦芽酚铝比较,麦芽酚铝+SB203580抑制剂组的凋亡率和坏死率均降低,且差异有统计学意义(P0.05);麦芽酚铝+SP600125抑制剂组的凋亡率和坏死率的差异无统计学意义(P0.05);麦芽酚铝+U0126抑制剂组的凋亡率和坏死率均上升,且差异有统计学意义(P0.05)。(4)Western-blot结果:加入P38抑制剂SB203580后,各个组之间的P38蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P0.05);p-P38相对表达量的差异有统计学意义(P0.05),与空白对照组比较,SB203580抑制剂组、麦芽酚铝组和麦芽酚铝+SB203580抑制剂组的P38的磷酸化水平均发生变化,且差异有统计学意义(P0.05),与染铝组比较,SB203580抑制剂组和麦芽酚铝+SB203580抑制剂组的P38的磷酸化水平均降低,且差异有统计学意义(P0.05)。加入JNK抑制剂SP600125后,JNK的表达量未见明显差异,且无统计学意义(P0.05);空白对照组、DMSO溶剂对照组、SP600125抑制剂组、麦芽酚铝组和麦芽酚铝+SP600125抑制剂组未见有磷酸化。加入ERK抑制剂U0126后,各个组之间的ERK蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P0.05);p-ERK相对表达量的差异有统计学意义(P0.05),与空白对照组比较,U0126抑制剂组、麦芽酚铝组和麦芽酚铝+U0126抑制剂组的ERK的磷酸化水平均降低,且差异有统计学意义(P0.05),与染铝组比较,U0126抑制剂组和麦芽酚铝+U0126抑制剂组的ERK磷酸化水平均降低,且差异有统计学意义(P0.05)。结论:(1)麦芽酚铝可以诱导PC12细胞发生凋亡和程序性坏死。(2)P38MAPK信号通路的激活和ERK信号通路的失活能够促使PC12细胞发生凋亡和程序性坏死,JNK信号通路铝致PC12细胞的凋亡和坏死过程中没有影响。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of MAPK signaling pathway on apoptosis of maltol - induced PC12 cells by adding inhibitors of apoptosis ( z - VAD - fmk ) , necrosis inhibitor ( Nec - 1 ) and P38 , ERK and ERK . Methods : ( 1 ) PC12 cells were cultured in a constant temperature incubator at 37 鈩，

本文编号：1420118