三氯乙烯药疹样皮炎易感性标志物验证及免疫机制研究

发布时间：2018-02-02 19:36

本文关键词： 三氯乙烯三氯乙烯药疹样皮炎二氯乙酰氯 HLA-B~*1301 动物模型人类白细胞抗原　出处：《中国疾病预防控制中心》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：三氯乙烯(CHCl=CCl2,Trichloroethylene,TCE),是二碳有机氯溶剂中溶解力最强的一种,由于其卓越的性能广泛应用于生产生活各个领域。在TCE的生产和使用过程均有可能造成作业工人的健康损害。据统计,1993-2008年深圳市龙岗区发生职业中毒事故94宗,造成430人中毒,10人死亡,直接经济损失近4000万元,发病关联程度最大的是TCE。深圳宝安区1993-2002年调查资料显示,10年间全区共诊断各种职业病和职业中毒232例,有机溶剂职业中毒占90.1%,应用灰色关联分析法对职业病发展势态进行量化比较分析发现,与职业病发病总数关联程度最大也是TCE。1990～2005年,深圳市共发生职业病人数896人,其中死亡40人,死亡病例主要为三氯乙烯药疹样皮炎(dermatitis medicamentosa-like of Trichloroethylene,DMLT)患者(构成比为50.0%)。深圳宝安区2006年调查资料显示,治愈1例DMLT平均经济负担约8万元人民币,而死亡1例经济负担约28万元人民币。为减少此类经济损失,职业危害的一级和二级预防显得尤为重要。易感性生物标志物可用以筛检易感人群,保护高危人群,节约社会资源。在TCE暴露人群中开展生物标志物研究,对TCE暴露的危险度评价,探索TCE的致病机制,保护易感人群具有重要意义。本研究包括以下两个方面,第一,在人群中验证HLA-B81301等位基因作为DMLT易感性生物标志物的有效性；第二是探索DMLT动物模型的构建,为机制研究提供线索。一.HLA-B*1301等位基因作为DMLT易感性生物标志物的有效性验证本研究建立了1764人的队列。对深圳市19个街道共204家工厂进行问卷调查和采样,符合条件的工人共有1651人,男性948人(57.4%),女性703人(42.6%),年龄范围17～58岁(平均27.03岁)。采样结束后进行电话随访,全部研究对象随访时间90d,随访率93.6%。基因分型结果发现1651人中HLA-B*1301(+)158人(9.57%),发病12人(7.59%), HLA-B*1301(-)1493人(90.43%),发病4人(0.27%)。HLA-B*1301阳性的工人发病率显著高于HLA-B*1301阴性的工人(RR:28.35;95%CI:9.25-86.85),归因危险度百分比达96.44%,说明HLA-B*1301等位基因是DMLT发病的主要因素,充分验证了前期病例对照研究的结果。调整其他混杂因素之后应用多元Logistic回归分析发现,暴露类型(OR:8.88;95%CI:2.21-35.63)和HLA-B*1301基因型(OR:20.17;95%CI:5.74-70.58)是影响DMLT发病率的主要因素。因此,在就业前体检中进行HLA-B*1301等位基因筛查是减少DMLT发病的有效措施。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析结果表明,由于其阴性预测值为99.7%,HLA-B*1301等位基因检测特别适合于就业前筛查。假设就业前所有工人都进行HLA-B*1301基因筛查,阻止一例DMLT发病的NNS(为预防和治疗一次不良结果事件所需筛检的病人数,the number of people needed to screen in order to prevent/treatment an adverse outcome, NNS)为143,同时也说明在一般人群中筛查,HLA-B*1301基因是一个非常有效的易感性标志物。筛查143各工人的直接成本是7150元人民币,这远远低于一例发病者的治疗和护理费用(32043～64540元人民币)。该结果可以为早期预防措施的选择提供参考。二.DMLT动物模型的构建 1.TCE与二氯乙酰氯(dichloroacetyl chloride, DCAC)的致敏性研究分别以豚鼠、BALB/c小鼠、MRL/lrp小鼠为实验对象,参照OECD (406)皮肤变态反应实验方法进行三次诱导和一次激发,末次激发后24h,取血制备血清；取肝右叶10%福尔马林固定；取约3×3mm肝组织液氮冻存,留提RNA；余下肝组织和脾分别加入组织匀浆液匀浆,取上清检测细胞因子。结果显示,DCAC可引起72.7%的豚鼠皮肤出现红斑反应,根据Magnusson致敏强度分类为强度致敏物。BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠在致敏过程中,未观察到明显的过敏反应。激发的同时以激发浓度涂抹小鼠耳廓,也未观察到耳廓肿胀。激发后豚鼠皮肤出现明显的红斑和水肿,皮肤病理组织学检查发现,TCE和DCAC组豚鼠皮肤炎症细胞浸润真皮内毛细血管扩张、水肿,变应性反应明显。BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠皮肤未观察到异常反应。转氨酶的检测结果显示豚鼠、BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的TCE组转氨酶均无明显变化,豚鼠和BALB/c小鼠的DCAC组转氨酶轻度升高,P值分别为0.053和0.079。肝组织病理结果表明受试物组未出现明显异常。分别检测三种动物的血清、肝组织匀浆和脾组织匀浆液中IL-2、IL-4、IL-5、 IL-10、IL-12、IFN-γ、 GM-CSF和TNF-α八种细胞因子,结果显示,IL-2和IFN-γ表达水平TCE组低于对照组,差异有统计学意义(p0.05)。其他六种细胞因子在对照组、TCE组和DCAC组的比较中差异均无显著性。血清组IL-4和GM-CSF的表达显著高于肝匀浆组和脾匀浆组(p0.05)；肝匀浆组中IL-2、IL-12、 IFN-γ TNF-α水平高于血清组和脾匀浆组(p0.05),GM-CSF高于脾匀浆组但低于血清组(p0.05)；脾匀浆组的IL-5和IL-10高于肝匀浆组和血清组(p0.05)。据以上结果可以看出,应用该实验方法未能诱导出接近于DMLT的动物模型。但本次实验结果发现DCAC为强致敏物,有可能导致豚鼠和BALB/c、鼠出现肝损伤；并且提示,使用橄榄油溶解TCE和DCAC,采用OECD (406)皮肤变态反应实验过程,不能使BALB/c小鼠、MRL/lrp小鼠出现明显的过敏反应,这些实验结果对于今后的研究有一定参考价值。由于TCE的体内代谢过程较为复杂,进入机体后,TCE或其代谢产物可能需要与蛋白质载体偶联之后形成完全抗原才能被抗原提呈细胞提呈,进而诱导机体产生免疫应答。或者TCE及其代谢产物在体内与内源性蛋白(如热休克蛋白等)结合形成超抗原,并在接触TCE的同时,体内存在病毒感染、短小棒状杆菌等生物性佐剂分子,致使机体产生强烈的免疫反应。由此,根据过继免疫的原理,将TCE和DCAC诱导过的实验动物取样,将所取生物样品导入新的实验动物体内,观察实验动物是否出现致敏反应。 2.免疫过继实验构建TCE药疹样动物模型将SPF级BALB/c小鼠分两组,一组按照致敏过程每隔二天诱导接触TCE一次,另一组为溶剂对照。连续诱导3次,末次诱导后14h,取血制备血清,取肝、脾、肾分别制备三种组织匀浆。同时取扩增的人表皮细胞,一组直接用福尔马林杀死细胞,无菌生理盐水洗3次并调浓度为1.67x105/L,另一组以10mmol/L浓度TCE共培养24h后,用福尔马林杀死细胞,无菌生理盐水洗3次并调浓度为1.67x105/L。将以上所制备的血清(+／-)、肝组织匀浆(+／-)、脾组织匀浆(+／-)、肾组织匀浆(+／-)和人表皮细胞(+／-)作为过继免疫的受试物,转输到受体小鼠体内,观察动物反应。结果显示,小鼠皮下注射各组织匀浆液后24h,细胞组、血清组、肾组、脾组和对照组小鼠均无异常表现,毛顺滑,活跃,个别腹部有未吸收完全的皮丘。肝组小鼠(TCE-/+)多数被毛蓬松,活动减弱,呼吸频率增高,成疾病状态,腹部皮丘多未吸收。注射96h后,各组动物毛顺滑,活跃,表现良好。肾组个别动物腹部注射处出现微小丘状硬结,肝组动物腹侧有明显丘状硬结,为未吸收的组织匀浆形成肉芽肿样结节。激发后,耳廓涂抹未见明显反应。足跖肿胀明显,经多变量方差分析后发现,各组数据在0h、24h、48h、72h、96h五个时间点的数据差异有统计学意义。进一步分析显示,阳性对照组(DNCB)与其余各组之间差异均有显著性意义(p0.01),阴性对照组(NS)与肝匀浆组、脾匀浆组、肾匀浆组、血清组和细胞组之间差异均无显著性意义(p0.05),各组中TCE(-)和TCE(+)之间差异也无显著性意义(p0.05)。说明经过TCE诱导的组织匀浆和表皮细胞与未经过TCE诱导的组织匀浆和表皮细胞对造成小鼠足跖肿胀之间的差异无显著性意义。动物模型构建过程中,动物遗传特点、给药途径、免疫状态、受试物本身及其代谢产物、复合物形成等因素均影响目标表型的产生。也有研究发现,物种、品系、性别因素对TCE的吸收分布代谢过程影响很大,从而影响TCE的毒作用表现。那么,今后的模型构建研究中,尝试使用不同溶剂溶解,构建TCE及其代谢产物的复合抗原,选择对TCE代谢速率较慢的实验动物作为模型动物或许会出现新的突破。综上所述,本研究建立职业暴露队列,首次得出DMLT在职业暴露人群中的总发病率为0.91%。充分验证了前期病例对照研究的结果,证实携带HLA-B*1301基因型是TCE作业工人药疹样皮炎发病的主要暴露因素这一病因假说。并进行了HLA-B1301基因型作为DMLT易感性生物标志物初步的成本效果分析,为HLA-B*1301等位基因作为易感性生物标志物应用于就业前基因筛查提供有价值的资料。为探索DMLT的发病机制,本研究利用BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠构建动物模型,未达到满意的效果,但所得实验结果可为以后的研究提供有价值的信息。
[Abstract]:According to the survey data from 1993 to 2002 in Baoan District , Shenzhen Bao ' an area , there were 896 people who died of occupational diseases and occupational poisoning . The study included the following two aspects : First , the efficacy of HLA - B81301 allele as a biomarker of DMLT was verified in the population ; and the second was to explore the establishment of DMLT animal model and provide clues for the mechanism study . I . Validation of HLA - B * 1301 allele as a biomarker of DMLT susceptibility The study established 1764 people ' s queue . The survey and sampling were conducted for 204 factories in 19 streets in Shenzhen . The eligible workers were 1651 , male 948 ( 57.4 % ) , female 703 ( 42.6 % ) , age ranged from 17 to 58 years ( mean 27.03 years ) . After the end of sampling , telephone follow - up was conducted . The follow - up time of all study subjects was 90d and the follow - up rate was 93.6 % . The results showed that HLA - B * 1301 allele was the main factor to reduce the incidence of DMLT . The results showed that HLA - B * 1301 allele was the main factor to reduce the incidence of DMLT . II . Construction of DMLT Animal Model Study on the Sensitization of TCE and dichloroacetyl chloride ( DCAC ) In BALB / c mice and MRL / lpr mice , no obvious allergic reaction was observed in BALB / c mice and MRL / lpr mice . The levels of IL - 2 , IL - 4 , IL - 5 , IL - 10 , IL - 12 , IL - 5 , IL - 10 , IL - 12 , IFN - 纬 , GM - CSF and TNF - 伪 in serum of three kinds of animals were significantly higher than those in control group ( p < 0.05 ) . It can be seen from the above results that the experimental method failed to induce the animal model close to DMLT . However , it was found that DCAC was a strong sensitizer , which could lead to liver injury in guinea pigs and BALB / c mice . It was suggested that using olive oil to dissolve TCE and DCAC could not induce obvious allergic reactions in BALB / c mice and MRL / lrp mice . After entering the organism , TCE or its metabolites may need to be coupled with the protein carrier to form the superantigen after entering the organism , thus inducing the organism to generate immune response . 2 . Establishment of an Animal Model of TCE Drug eruption by Immune - adoptive Experiment The serum ( + / - ) , liver tissue homogenate ( + / - ) , spleen tissue homogenate ( + / - ) , renal tissue homogenate ( + / - ) and human epidermal cells ( + / - ) were treated with formalin . The results showed that there was no significant difference between the two groups ( P < 0.05 ) . After 96 hours of injection , there was no significant difference between the two groups ( P < 0.05 ) . The results showed that there was no significant difference between the two groups ( P < 0.05 ) . In the process of animal model construction , animal genetic characteristics , administration route , immune status , test article itself and its metabolites , complex formation , etc . all affect the production of target phenotype . In conclusion , this study establishes occupational exposure cohorts , and the overall incidence rate of DMLT in occupational exposure population is 0.91 % . The results of early case - control studies have been fully validated . It is confirmed that HLA - B * 1301 genotype is the main exposure factor for the pathogenesis of drug eruption dermatitis in TCE workers .

【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R135.1

【参考文献】