TNF-α和NF-κB在THP-1细胞促煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶变过程中的作用
发布时间：2018-02-10 18:32
本文关键词： 煤焦沥青 炎症 肿瘤坏死因子α 肿瘤相关巨噬细胞 NF-κB 出处：《郑州大学》2012年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：背景 众多动物实验及流行病学调查资料显示,慢性炎症与肿瘤发生之间存在因果关系。肿瘤相关巨噬细胞是存在于肿瘤微环境中的炎症细胞,在肿瘤的发生、侵袭及转移起重要作用。肿瘤坏死因子a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)是由肿瘤相关巨噬细胞分泌、参与炎症的重要细胞因子,可作为肿瘤的促进因子。核转录因子(Nuclear factor-kappa B, NF-κB)是连接炎症和癌症的重要转录因子,可调控细胞增殖、凋亡等相关基因,参与人类许多肿瘤发生。 TNFR--TRAD--RIP--TRAF2--IKK--NF-κB通路是激活NF-κB的通路之一。煤焦沥青广泛存在于工业生产中,是炼焦作业后产生的副产物,现已被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)列为确切致癌物。目前,大多数研究着重于煤焦沥青这一单独因素引发肺癌机制,而关于炎症在其致肺癌的过程中作用如何、机制如何报道较少,需要进一步的研究进行阐明清楚。 课题组前期工作：利用中温煤焦沥青烟提取物(Coal tar pitch Volatiles, CTPVs)为染毒物,作用于人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)后,BEAS-2B细胞出现恶性转化；利用BEAS-2B细胞与巨噬细胞的前体人单核细胞系THP-1细胞共培养,THP-1细胞可促进CTP诱导BEAS-2B细胞恶性转化；且在细胞的恶性转化中NF-κB p65蛋白及基因表达量升高。在课题组前期工作的基础上,该研究欲从THP-1分泌细胞因子TNF-α以及核转录因子NF-κB信号转导通路TNFR--TRADD--RIP-TRAF2-IKK--NF-κB方面加以分析,探讨炎症促癌的可能机制,以期为煤焦沥青所致职业性肺癌提供早期预防理论依据及肺癌早期诊断的生物标志。 方法 1检测两种培养方式的细胞上清TNF-α的表达水平：BEAS-2B细胞与THP-1细胞共培养,两细胞培养比列为10：1,经CTP染毒；单独培养的BEAS-2B细胞经CTP染毒。收集共培养细胞及单独培养的BEAS-2B细胞代谢液上清,利用ELISA方法检测不同培养方式细胞上清液中细胞因子TNF-α的表达水平。 2检测细胞的恶性转化情况：共培养细胞培养至10代时分为3组：一组加入NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯(pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC),为PDTC组：一组细胞加入TNF-a中和抗体,为中和抗体组；一组细胞继续培养,为对照组。3组细胞同时常规传代培养至20代,应用流式细胞仪测定细胞周期、软琼脂集落形成实验及染色体数目畸变分析检测10代对照组、20代对照组、20代中和抗体组及20代PDTC组细胞恶性转化指标。 3检测基因及蛋白的表达情况：利用Western Blotting检测10代对照组、20代对照组、20代中和抗体组及20代PDTC组细胞总蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor2, TRAF2)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表达水平及细胞胞核蛋白NF-κB p65的表达水平。利用RT-PCR分别检测TRAF2、 CyclinD1、NF-κB p65mRNA的表达变化。 结果 1ELISA测定共培养及单独培养BEAS-2B细胞代谢液中TNF-a表达水平：结果显示共培养细胞较单独培养细胞在10代、15代、20代、25代、30代时TNF-α的含量高,差异有统计学意义(P0.05)。 2细胞的恶性转化情况： 2.1流式细胞仪测细胞周期：流式细胞仪检测细胞周期发现,20代对照组细胞相比10代对照组细胞G1期细胞比例减少(P0.05),S期细胞所占比例增加,表明经CTPVs染毒的细胞随着细胞代数的增加其恶性程度随之增加。20代中和抗体组与20代PDTC组细胞S期细胞所占比例分别相比与对照组细胞较低,差异有统计学意义(P0.05)。 2.2染色体数目畸变分析：实验结果显示,在10代对照组细胞中,染色体数目异常已经显现。20代对照组较10代对照组细胞非2倍体数目增多；20代中和抗体组、20代PDTC组细胞分别与20代对照组比较,染色体畸变率较低,非2倍体数目降低,差异具有统计学意义(P0.0083)。 2.3软琼脂集落形成试验：克隆形成以细胞数目超过50个为标准,10代对照组细胞形成克隆数在20个左右；20代对照组细胞形成大量克隆,恶性程度增高；20代中和抗体组以及20代PDTC组细胞克隆形成数目肉眼观察明显少于20代对照组；经两两比较发现：20代对照组与20代中和抗体组、20代PDTC组细胞相比差异分别具有统计学意义(P0.05)。 3基因及蛋白的表达情况： 3.1TRAF2、 CyclinD1、 NF-κBp65基因表达情况：分别对10代对照组、20代对照组、20代PDTC组及20代中和抗体组TRAF2、 CyclinD1、 NF-κB p65mRNA进行比较,结果显示,20代对照组细胞NF-κB p65、 TRAF2、 CyclinDl mRNA相对表达量均高于10代对照组、PDTC组及中和抗体组,差异有统计学意义(P0.05)。 3.2TRAF2、CyclinD1、 NF-κB p65蛋白表达情况：分别对10代对照组、20代对照组、20代PDTC组及20代中和抗体组TRAF2、 CyclinD1、NF-κB蛋白相对表达量进行比较,结果显示,20代对照组胞核蛋白NF-κB p65、总蛋白TRAF2、 CyclinD1相对表达量均高于10代对照组、PDTC组及中和抗体组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论 THP-1细胞加速煤焦沥青烟气提取物诱导BEAS-2B细胞恶变过程中,THP-1可能通过分泌细胞因子TNF-α发挥作用；TNF-α与其受体相结合后可能通过TNFR--TRADD--R1P--TRAF2--IKK-NF-κB通路激活NF-κB,从而发挥促肿瘤的作用。
[Abstract]:background
Data in a number of animal experiments and epidemiological investigation showed that the causal relationship between chronic inflammation and cancer. Tumor associated macrophages in the tumor microenvironment in inflammatory cells in tumorigenesis, invasion and metastasis plays an important role. Tumor necrosis factor A (Tumor necrosis factor-A, TNF-a) is secreted by tumor associated macrophages, important cytokines are involved in inflammation, can be used as a tumor promoting factor. The nuclear transcription factor (Nuclear factor-kappa B, NF- K B) is an important transcription factor linking inflammation and cancer, can regulate cell proliferation, apoptosis related genes, involved in many human tumors.
TNFR--TRAD--RIP--TRAF2--IKK--NF-魏B閫氳矾鏄縺娲籒F-魏B鐨勯，
本文编号：1501160
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